基因敲除与基因沉默

基因敲除与基因沉默

吕学诜,吕仁杰,吕　超

(佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007)

关键词:基因打靶;基因敲除;基因沉默

中图分类号:Q785　文献标识码:A　文章编号:1008-0104(2009)05-0065-01　　基因敲除(geneknockout)与基因沉默(genesilencing)替换另一种基因,以便在体内测定它们是否具有相同的功都是自上世纪80～90年代以来发展起来的两种新型分子生能,或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基物学技术,二者既有许多相同之处,又有本质的不同。但是,因治疗的目的。基因敲入又称基因置换,它是利用内源基因近来有很多文章常把二者搞混,最常见的是误把本属基因沉序列两侧或外面的断裂点,用同源序列的目的基因整个置换默的RNA干扰(RNAi)说成是基因敲除。这对进一步深入研内源基因[6,7]。究和应用这两种分子生物学技术都会造成不应有的后果。因目前,无

论在基因功能研究和动物疾病模型研制方面,此,我们必须了解二者的特点和异同。还是在动物育种、动物反应器和异种器官移植方面,甚至在1　基因打靶(genetargeting)基因治疗中,基因打靶都具有广泛的应用前景。但就目前打

靶效率仍然较低的情况而言,进一步研究改进基因打靶的基因打靶是利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个

策略,提高打靶效率,以及发展可诱导的时空特异性基因打体遗传信息定向改变的定向转基因技术。基因打靶技术是20

靶将是今后的重要科学任务。世纪80年代发展起来的分子生物学新技术[1,2],是在转基因技术、胚胎干细胞技术和人工同源重组技术基础上发展起来

的,它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是目前能精确修饰、改造生物基因组最理想、最有效的一种方法。通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等,并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传,表达突变的性状。基因打靶技术的发展克服了原有转基因技术随机整合的弊端,使生物体基因的时空表达得以控制,从而为生命科学、基因组学、疾病治疗和新药筛选评价模型等领域的研究和应用提供了强大的工具。美国科学家MarioR.Capecchi,OliverSmithies和英国科学家MartinJ.Evans因基因打靶技术的开创性研究而获得了2007年度诺贝尔生理学或医学奖[3]。经过20多年的发展,基因打靶技术根据所用靶细胞的不同,基因打靶分为胚胎干细胞(EmbryonicStemcell,ES)打靶和体细胞(somaticcell)打靶两类;基因打靶的常用方法包括基因敲除、基因敲入(geneknockin)、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等。1.1　基因敲除

基因敲除(geneknockout)是通过同源重组使特定靶基因失活,是基因打靶最常用的一种策略。基因敲除主要包括下列技术:¹构建重组载体;º重组DNA转入受体细胞核内;»中靶阳性细胞的筛选;¼转基因动物。基因敲除主要策略:¹完全基因敲除(completeknock-out);º组织特异性基因敲除法;»大规模随机基因敲除——基因捕获(genetrapping);¼精细突变的引入(目前较为常用的方法主要有“、“以及基于重组酶系统的HitandRun”TagandExchange”方法)[4]。

由于绝大多数细胞难以发生同源重组介导的基因敲除,因而敲除成功的几率非常之低。近期研究人员利用DNA修复易于出错的缺陷,通过锌指DNA结合结构域(zinc-fingerDNA-bindingdomain)将核酸酶靶定至目的基因处,从而构建出敲除目的基因的哺乳动物细胞系。这一方法的一大优势是不需要使用选择标记;另外,在使用新方法进行敲除时,两个等位基因都发生突变的频率相对较高[5]。1.2　基因敲入

2　基因沉默

基因沉默(genesilencing)是指由于各种原因,在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默发生在两种水平上,一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默(transcriptionalgenesilencing,TGS),另一种是转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS),即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活,包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

目前小RNA的研究已进入了全新的层次,以往被认为是没有用的小RNA现已成为研究的焦点[8]。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象,也是近几年发展起来的引起转录后基因沉默的新技术。目前已广泛地应用于多学科的研究中,尤以医学领域的研究最为突出,它不仅可用于基础医学研究,而且为病毒感染性疾病和肿瘤的防治开辟了更为广阔的前景。2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予了斯坦福医学院的AndrewZ.Fire和麻省理工大学医学院的CraigC.Mello,以表彰他们在RNAi领域的杰出贡献[9];微小RNA(MicroRNA,miRNA)是新近证明的一类高度保守的、内源性非蛋白编码的长度约为22nt左右的小分子单链RNA[9]。它普遍存在于植物、无脊椎动物和脊椎动物的基因组中,并且在转录后水平调节基因的表达。据miRBase序列数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)统计至2009年2月已发现miRNA序列8619条,人类细胞中已发现695条。miRNA的组织特异性和时序性,决定组织和细胞的功能特异性,表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。近期报道,单个miRNA能够影响数百种蛋白质的

[10]

表达,miRNA对哺乳动物免疫系统具有重要的调控意义[11]。

3　基因敲除与基因沉默的异同

基因敲除与基因沉默都是使目的基因不表达的生物学技术,但“基因敲除”是通过DNA序列改变,出现基因功能的“全或无”表象。虽然有时由于基因拷贝数或基因同效,使基

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　黑龙江医药科学　2009年10月第32卷第5期?66?

89例消化性溃疡病人的健康教育反馈

苏红梅,王玉萍,戚晓华

(佳木斯大学附属第一医院消化内科,黑龙江佳木斯154003)

关键词:消化性溃疡;健康教育

中图分类号:R573.1;R193　文献标识码:B　文章编号:1008-0104(2009)05-0066-02　　消化性溃疡(pepticulcer,PU)可发生于食管、胃、十二指胃溃疡患者30例,十二指肠溃疡患者35例,其它类型溃疡24肠、胃—空肠吻合口和具有胃黏膜的Meckel憩室。其中胃和例,所有患者病史及服用抗酸药物史均想超过1年以上。男56十二指肠球部溃疡最常见,故消化性溃疡通常是指胃和十二例,女33例,年龄17～68岁(平均38.5岁)。文化程度:小学及指肠溃疡,分别又称为胃溃疡(gastriculcer,GS)和十二指肠以下10例,初高中45例,大专以上34例。平均住院2周。随机将溃疡(duodenunulcer,DU)[1]。消化性溃疡是典型的心身疾病其分为实验组45例,对照组44例,两组在年龄、性别、文化程之一,疼痛具有周期性发作特点,一般秋冬至早春为好发季度和消化性溃疡分类方面比较差异无统计学意义节。经内科治疗后容易复发,也容易引起大出血、急性穿孔等(P<0.05)。除按溃疡类型不同给治疗外,其余治疗护理力

[2]

严重并发症,约有5%胃溃疡病例可以发生恶变。本人从事求一致。临床护理工作多年,看到很多溃疡病患者不遵循医嘱坚持治1.2　方法疗,病情好转后就自行停药,后又反复住院,主要原因是患者对消化性溃疡住院患者,按住院先后顺序人为分为单双缺乏健康知识。故本文对89例消化性溃疡患者出院1年后复计数,留下每个患者的联系电话。对单数患者进行健康教育发情况进行了调查,现报道如下。计划(实验组),采用整体护理模式对病人进行健康教育。对1　对象与方法双数患者(对照组)不实施健康教育计划,当患者主动询问消1.1　对象

89例患者为我院2007-01～2007-05住院治疗的消化性溃疡患者,按ICD-10国际疾病编码标准进行分类,其中(上接第65页)

因敲除后不能达到基因功能全无的效果,而这正是在基因敲除实验设计时要充分考虑的问题。基因沉默技术是以不改变

按DNA序列为前提,使基因沉默,即基因不表达或低表达。

其实质主要是使基因敲低(geneknockdown),虽然有时可达到基因完全沉默。基因沉默通过敲低基因也可以从量上控制基因表达,在生物体内研究其表型谱。因此,在研究基因功能或建立转基因动物中,不可轻易以基因沉默代替基因敲除技术。

由于基因打靶可以实现细胞或动物特定靶基因功能的丧失而具有其它方法难以比拟的直接性和有效性。利用基因打靶获得的细胞可以在细胞水平上研究基因突变对细胞发育和调控及免疫细胞作用的影响等。各种生物基因沉默比较研究结果表明,从比较低等的生物藻类、真菌到高等的植物再到动物线虫、锥虫、果蝇等中可能存在着一个由共同祖先进化来的相似的抵抗外来DNA侵入自身基因组的本能防卫机制。而基因打靶是基因工程技术。与传统的打靶技术相比较,RNAi的操作简单,花费的时间短,已经成为基因沉默的重要工具。同时,RNAi技术也已经可以通过shRNA表达盒子能够在细胞中像在动物模型中一样产生有效的、稳定的和可调节的基因沉默作用。但是在基因表达的蛋白的结构异常等研究中,RNAi是无法取代基因敲除的作用的。

正因为基因沉默没有改变DNA序列,所以可塑性很大。如果某些肿瘤是由于原癌基因的激活或/和抑癌基因的失活引起,在基因治疗中就可以利用基因沉默反其道而行之。当我们对miRNA在细胞生长和发育过程的调节作用及其在免疫系统的重要调控作用有了进一步深入了解之后,我们不仅可以揭示很多疾病的发病机理,而且可以利用各种特异的miRNA进行分子诊断或分子治疗。

化性溃疡有关知识时,只根据所提问题做出简单必要的解释。

参考文献:

[1]ThomasKR,CapecchiMR.Site-directedmutagenesisbygene

targetinginmouseembryo-derivedstemcells[J].Cell,1987,51(3):5035

[2]DoetschmanT,GreggRG,MaedaN,etal.Targettedcorrectionofa

mutantHPRTgeneinmouseembryonicstemcells[J].Nature,1987,330(6148):576-578

[3]http://wendang.chazidian.com/nobel-prizes/medicine/laureates/2007/

index.html

[4]MullerU.Tenyearsofgenetargeting:targetedmousemutants,

fromvectordesigntophenotypeanalysis[J].Mech-Dev,1999,82(1-2):3-21

[5]SantiagoY,ChanE,LiuPQ,etal.Targetedgeneknockoutin

mammaliancellsusingengineeredzinc-fingernucleases[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(15):5809-5814

[6]TateishiS,NiwaH,MiyazakiJ,etal.Enhancedgenomicinstability

anddefectivepostreplicationrepairinRAD18knockoutmouseembryonicstemcells[J].MolCellBiol,2003,23(2):474-481[7]KerkhofsS,DenayerS,HaelensA,etal.Androgenreceptor

knockoutandknock-inmousemodels[J].JMolEndocrinol,2009,42(1):11-17

[8]SunBK,TsaoH.SmallRNAsindevelopmentanddisease[J].JAm

AcadDermatol,2008,59(5):725-737

[9]BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and

function[J].Cell,2004,116(2):281-297

[10]SelbachM,SchwanhausserB,ThierfelderN,etal.Widespread

changesinproteinsynthesisinducedbymicroRNAs[J].Nature,2008,455(7209):58-63

[11]XiaoC,RajewskyK.MicroRNAcontrolintheimmunesystem:

basicprinciples[J].Cell,2009,136(1):26-36

(收稿日期:2009-05-14)