我国草鱼野生群体DLoop序列遗传变异分析_傅建军

第39卷 第2期

水生生物学报

ACTAHYDROBIOLOGICASINICA

2015年3月doi: 10.7541/2015.46

Vol. 39, No.2 Mar., 2 0 1 5

我国草鱼野生群体D-Loop序列遗传变异分析

傅建军1, 2 王荣泉3 沈玉帮1 宣云峰3 徐晓雁1 刘承初2 李家乐1

(1. 上海海洋大学省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室, 上海 201306; 2. 上海海洋大学食品科学与工程博士

后流动站, 上海 201306; 3. 苏州市吴江水产养殖有限公司, 农业部大宗淡水鱼类繁育与健康养殖技术重点实验室,

苏州 215221)

摘要: 利用线粒体DNA的D-Loop区序列, 对来自长江水系(邗江、吴江、九江、石首、木洞和万州)、珠江水系(肇庆)和黑龙江水系(嫩江)的8个草鱼野生群体开展了遗传变异分析。在424尾鱼中检测到34个变异位点, 34个单倍型, 单倍型多样性介于0.474—0.708。群体间Kimura双参数遗传距离介于0.0020—0.0049。长江下游3个群体间遗传距离最近, 遗传分化不显著(P>0.05); 肇庆群体与长江上游3个群体遗传距离较近, 与九江群体遗传分化不显著(P>0.05); 嫩江群体与长江上游2个群体遗传距离较近, 与万州群体遗传分化不显著(P>0.05)。遗传距离与地理距离存在极显著正相关(R=0.61, P<0.01)。分子方差分析显示, 不同流域间遗传变异占总变异26.24%, 差异极显著(P<0.01)。34个单倍型分为2个分支, 分化极显著(FST=0.644, P<0.01), 推测分化时间为第四纪更新世纪晚期。

关键词: 草鱼; 野生群体; D-Loop序列; 遗传变异

中图分类号: Q346+.1 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2015)02-0349-09

草鱼(Ctenopharyngodon idella)为我国土著鱼类, 自然分布于长江、珠江及黑龙江水系等流域中[1]。草鱼在我国具有悠久的养殖历史, 其养殖产量在淡近几十年来, 由于受环境水鱼类中位居世界第一[2]。

破坏及不当利用等原因[3], 草鱼野生资源锐减并存在种质退化风险。当前, 开展良种培育是减少对草鱼野生资源过度开发和破坏, 并实现草鱼资源可持续利用的有效途径。

分子标记作为鱼类种质资源研究的有效手段[4], 可为制定合理的育种方案提供数据参考。其中, 线粒体DNA(mtDNA)变异可用于鱼类亲缘关系[5]、种属分类[6]、遗传分化[7]和遗传多样性[8]等研究。mtDNA标记被广泛用于草鱼群体遗传研究中。李思发等[9]和张四明等[10]用mtDNA限制性片段长度多态性(RFLP)方法分别对长江中下游和中游水系草鱼群体开展了遗传变异研究; Zhao等[11]基于3个线粒

体编码基因(ND5、ND6和Cytb)和控制区(D-Loop)序列对长江流域草鱼群体进行了遗传结构及演化进行了分析; 宋晓等[12]通过线粒体D-Loop区和COⅡ基因序列对我国土著群体和国外移居群体进行了遗传变异分析; 李树华等[13]基于线粒体D-Loop和Cytb基因序列对长江中游草鱼亲本增殖放流的遗传效果进行了评估。此外, 诸如RAPD[14]、TRAP[15]、ISSR[16]和SSR[17—19]等其他分子标记被广泛用于草鱼群体遗传研究。然而, 众多研究在样本采集、研究方法及侧重点等方面存在差异, 因此具有进一步开展草鱼群体遗传结构研究的必要。

本研究对长江、珠江和黑龙江水系的8个草鱼野生群体的mtDNA D-Loop序列进行PCR扩增和测序, 开展了群体间遗传变异和系统分化等研究, 旨在补充完善我国草鱼野生群体的种质资源研究, 为后期遗传育种提供数据参考。

收稿日期: 2014-04-21; 修订日期: 2014-09-11

基金项目: 现代农业产业技术体系建设项目(编号: CARS-46-04); 国家科技支撑计划项目-大宗淡水主养鱼类新品种选育(编号:

2012BAD26B02); 上海市重点学科建设项目(编号: Y1101)资助

作者简介: 傅建军(1986—), 男; 浙江金华人; 博士; 研究方向为水产动物种质资源与遗传育种。E-mail: jjfu@http://wendang.chazidian.com 通信作者: 李家乐, 教授, 博士生导师; 研究方向为水产动物种质资源与遗传育种。E-mail: jlli2009@http://wendang.chazidian.com

350 水生生物学报 39卷

1 材料与方法

1.1 实验材料与DNA提取

草鱼8个野生群体收集于长江、珠江及黑龙江水系(表1), 在前期研究[19]的基础上补充了一些个

体(2013年5月)。实验样本为剪取的鳍条组织, 以无水乙醇固定。基因组DNA采用苯酚/氯仿法提取, 通过1% 琼脂糖胶检测其完整性, 经NanoDrop分光光度仪检测其纯度及浓度。DNA样品被稀释成20 ng/µL的终浓度, 保存于–20℃备用。

表1 草鱼样本采集信息

Tab. 1 Sampling information of C. idella

群体 Population 邗江 HJ 吴江 WJ 九江 JJ 石首 SS 木洞 MD 万州 WZ 肇庆 ZQ 嫩江 NJ

采样地 Location 江苏 邗江 江苏 吴江 江西 九江 湖北 石首 重庆 木洞 重庆 万州 广东 肇庆 黑龙江 嫩江

经纬度

Longitude & Latitude +119.43, +32.35 +120.53, +31.06 +115.96, +29.72 +112.39, +29.74 +106.85, +29.57 +108.45, +30.83 +112.53, +23.08 +125.22, +49.21

样本数 No. 44 71 44 71 24 48 59 63

1.2 PCR扩增与测序

根据草鱼mtDNA全序列[20](GenBank序列号: NC_010288)设计D-Loop区的引物, 引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物和下游引物序列分别为: DLF: 5?-CCTAGCGCCCAGAAAAGGGAGAT T-3?; DLR: 5?-GCGGGGGATTGAGGGCATACTC-3?。

PCR扩增体系为50 μL, 包括10× PCR Buffer 3 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 5 μL、MgCl2 (25 mmol/L)、4 μL、TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL) 1 μL、上游及下游引物(10 mmol/L)各1 μL、基因组DNA (20 ng/μL) 2 μL, 补充无菌水33 μL。所需试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。PCR扩增程序为: 94℃预变性3min; 94℃变性30s, 50℃复性30s, 72℃延伸2min, 扩增35个循环; 72℃延伸10min; 4℃保存。扩增反应在Eppendorf梯度PCR仪上完成。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 由上海迈浦生物科技有限公司通过ABI3730XL测序仪进行双向测序。 1.3 序列整理与数据分析

使用BioEdit 7.0软件[21]进行序列编辑, 并用Clustal X 1.81软件[22]进行同源比对和长度确定。采用DnaSP 5.0软件[23]统计多态性位点数(S)、单倍型个数(H)、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)、平均核苷酸差异数(K)和Tajima’s D值等遗传多样性参数。

利用Arlequin 3.5软件[24]进行核苷酸组成统计、

分子方差分析(AMOVA)和遗传分化指数(F-statistics, FST)计算。利用MEGA 5.1软件[25]计算群体间的Kimura双参数模型(Kimura 2 Parameter, K2P)遗传距离, 并构建邻接(Neighbor-Joining, NJ)进化树。根据各采样点间的地理距离[26], 利用SPSS 16.0软件[27]分析与遗传距离间的相关性。

利用MEGA 5.1软件对单倍型构建最大简约(Maximum Parsimony, MP)进化树, 并计算单倍型分支间的K2P遗传距离, 利用Network 4.6软件[28]构建单倍型的简约中介(Reduced-Median, MJ)网络图, 并推算单倍型分化时间。

2 结果

2.1 草鱼D-Loop序列的变异位点与单倍型分布

共测序获得424尾草鱼的D-Loop区(898 bp)序列。核苷酸组成显示A+T含量(66.71%)明显高于G+C含量(33.29%)。在D-Loop区共发现34个变异位点。共检测到34个单倍型, 其中Hap1、Hap6、Hap20和Hap21为优势单倍型, 分别占个体数的32.31%、10.14%、28.54%和13.21%; 20个单倍型为除肇庆群体外的各群体所特有(表2)。

2.2 草鱼野生群体遗传多样性与群体间遗传距离

我国草鱼野生群体整体单倍型多样性为0.787(表3)。各群体的单倍型多样性介于0.474— 0.708, 核苷酸多样性介于0.0018—0.0037。其中, 吴

2期 傅建军等: 我国草鱼野生群体D-Loop序列遗传变异分析 351

表2 草鱼群体中的单倍型分布情况

Tab. 2 Distribution of the haplotypes in C. idella populations

各群体中各单倍型个体数 No. of haplotypes for each population

单倍型

Haplotype 序列号 Accession 邗江

HJ 吴江 WJ 九江 JJ 石首 SS 木洞 MD 万州 WZ 肇庆 ZQ 嫩江 NJ 总体 Total

Hap1 KJ614530 26 51 27 10 23 137

Hap2 KJ614531 3 1 4

Hap3 KJ614532 1 1 2

Hap4 KJ614533 1 2 3

Hap5 KJ614534 1 1 2

Hap6 KJ614535 5 8 8 1 21 43

Hap7 KJ614536 1 2 1 4

Hap8 KJ614537 1 1

Hap9 KJ614538 1 1 1 3

Hap10 KJ614539 1 1 9 11

Hap11 KJ614540 1 1

Hap12 KJ614541 7 2 9

Hap13 KJ614542 1 1

Hap14 KJ614543 1 1

Hap15 KJ614544 1 1

Hap16 KJ614545 1 1 2

Hap17 KJ614546 1 1

Hap18 KJ614547 1 1 2

Hap19 KJ614548 1 1

Hap20 KJ614549 48 16 27 30 121

Hap21 KJ614550 6 4 18 28 56

Hap22 KJ614551 3 3

Hap23 KJ614552 1 1

Hap24 KJ614553 1 1

Hap25 KJ614554 1 1

Hap26 KJ614555 1 1

Hap27 KJ614556 1 1

Hap28 KJ614557 1 1

Hap29 KJ614558 1 1

Hap30 KJ614559 1 1

Hap31 KJ614560 1 1

Hap32 KJ614561 4 4

Hap33 KJ614562 1 1

Hap34 KJ614563 1 1

江群体的遗传多样性水平最低(Hd= 0.474, π=0.0018),

肇庆群体的单倍型多样性最高(Hd=0.708), 嫩江群体

的核苷酸多样性最高(π=0.0037)。群体中性检验显示,

邗江、吴江、九江和石首群体的Tajima’s D值为负

值; 其余群体为正值, 其中肇庆群体显著偏离中性

(P<0.05)。

我国草鱼野生群体间K2P遗传距离介于0.0020— 0.0049, 如表4(左下角), 其中邗江与吴江群体间遗传距离最近, 嫩江与邗江群体的遗传距离最远。遗传距离与地理距离具极显著正相关(R=0.61, P<0.01, 图1)。基于群体间K2P遗传距离构建NJ树显示, 8个群体聚为2支(图2)。其中一支由长江下游的邗江群体(HJ)、吴江群体(WJ)和九江群体(JJ)首先聚类, 再与肇庆群体(ZQ)聚类; 另一支由石首群体(SS)先

352 水生生物学报 39卷

表3 草鱼群体D-Loop区序列遗传多样性参数

Tab. 3 Genetic diversity parameters of D-Loop sequence of C. idella populations

群体

Population 邗江HJ 吴江WJ 九江JJ 石首SS 木洞MD 万州WZ 肇庆ZQ 嫩江NJ 总体 Total

多态性位点数

S

单倍型数

H

单倍型多样性

Hd

核苷酸多样性

π

平均核苷酸差异数

K

Tajima’s D

12 9 0.624 0.0022 1.945 –0.892 12 11 0.474 0.0018 1.610 –0.981 12 10 0.598 0.0026 2.314 –0.488 13 7 0.520 0.0018 1.596 –1.152 8 4 0.533 0.0027 2.377 0.351 8 5 0.553 0.0033 2.965 1.774 8 8 0.708 0.0035 3.175 2.233*

14 7 0.584 0.0037 3.296 0.320 34 34 0.787 0.0034 3.050 –1.093

注:* 表示达到显著性水平(P<0.05)

Note:* means of statistical significant (P<0.05)

表4 草鱼群体间的K2P遗传距离(左下角)和遗传分化指数FST(右上角)

Tab. 4 Pairwise K2P genetic distances (below diagonal) and fixation indexes (FST, above diagonal) among C. idella populations 邗江HJ 吴江WJ 九江 JJ 石首SS 木洞MD 万州WZ 肇庆ZQ 嫩江NJ

邗江HJ

吴江WJ

九江JJ

石首SS

木洞MD

万州WZ

肇庆ZQ

嫩江NJ

–0.0017 –0.0011 0.2944** 0.3252** 0.3475** 0.1176** 0.3801** 0.0020 0.0018 0.3057** 0.3586** 0.3820** 0.1347** 0.4135** 0.0024 0.0022

0.2880** 0.2884** 0.2980** 0.0542 0.3264**

0.0366 0.1771** 0.3393** 0.2647**

0.0367 0.2780** 0.1085*

0.2389** 0.0019

0.2413**

0.0028 0.0026 0.0030

0.0036 0.0034 0.0037 0.0023

0.0043 0.0041 0.0042 0.0031 0.0031

0.0033 0.0031 0.0033 0.0040 0.0044 0.0045

0.0049 0.0047 0.0047 0.0037 0.0036 0.0035 0.0048

注: * 表示遗传分化显著(P<0.05); **表示遗传分化极显著(P<0.01)

Note: * and ** means of significant and extreme significant of genetic differentiation, respectively

图2 草鱼群体基于D-Loop序列变异的NJ系统树 Fig. 2 NJ tree based on D-Loop sequences of C. idella popula-tions

图1 草鱼群体间K2P遗传距离与地理距离的散点图 Fig. 1 Scatterplot between K2P genetic and geography distances

among C. idella populations

上角)所示。其中长江下游3个群体(HJ、WJ和JJ)之间及其他4对群体间(JJ与ZQ、SS与MD、MD与WZ、及WZ与NJ)遗传分化不显著(P>0.05); 其余群体间遗传分化均达显著水平(P<0.05)或极显著水平(P<0.05)。

基于遗传分化分析的结果, 将8个群体分成5组, 长江水系分成上游(MD和WZ)、中游(SS)和下游(HJ、WJ和JJ)流域, 及珠江流域(ZQ)和黑龙江流

与长江上游的木洞群体(MD)和万州群体(WZ)聚类, 然后与嫩江群体(NJ)聚类; 最后, 以上2个分支聚到一起。

2.3 草鱼野生群体间遗传分化

我国草鱼野生群体间的遗传分化指数如表4(右

2期 傅建军等: 我国草鱼野生群体D-Loop序列遗传变异分析 353

域(NJ), 进行分子方差分析(AMOVA), 结果如表5所示, 不同流域间的方差组分占26.24%, 遗传分化

指数FST为0.262, 达极显著水平(P<0.01), 说明不同水系间及长江水系不同江段间存在显著遗传分化。

表5 草鱼群体D-Loop序列变异的分子方差分析(AMOVA)

Tab. 5 Analysis of molecular variances of D-Loop sequences of C. idella populations

变异来源 Source of variation

不同流域间Among groups 流域内群体间

Among populations within groups群体内Within populations 总变异Total

自由度 df

平方和 Sum of squares

方差组分

Variance components

0.427 0.0103 1.1901 1.6274

百分率

Percentage of variation (%)

26.24 0.63 73.13

固定指数 Fixation indices

0.262**

0.009 0.269**

4 144.946 3 4.953 416 495.073 423 644.972

注: **表示差异极显著(P<0.01)

Note: ** means of statistical extreme significant

2.4 草鱼单倍型的发生关系

基于草鱼单倍型构建MP进化树(图3), 34个单倍型被分为2个主分支(LGA和LGB)。其中LGA包含26个单倍型, 有308尾鱼, 为优势分支; LGB包含8个单倍型, 有116尾鱼。分支间平均K2P遗传距离为0.0087, 分化水平极显著(FST =0.644, P<0.01)。

利用单倍型构建的MJ网络图与MP进化树相吻合(图4)。2个分支各有2个优势单倍型, 并具有一定的地域性; 其中2个为长江中下游4个群体和肇庆群体所有, 另外2个为长江中上游3个群体和嫩江群体所有。估算4个优势单倍型间的分化时钟, 不同分支的优势单倍型间分化时间介于距今51077—28924年前, 分支内优势单倍型间分化时间介于距今11414—9464年前, 依此推测2个单倍型分支的分化大约发生在第四纪更新世晚期。

单倍型。因此, 在样本数充足的情况下, 可只用D-Loop区等序列开展遗传变异分析, 以降低实验成本; 而当样本量不太充足时, 建议增加mtDNA序列片段来开展群体遗传研究。

3 讨论

3.1 草鱼D-Loop区的变异特征

本研究对草鱼D-Loop区序列分析表明, A+T含量达到66.71%, 明显高于G+C含量, 这与Zhao等[11]在草鱼中研究发现66.8%的A+T含量相符合。研究发现草鱼D-Loop区34个变异位点, 34个单倍型, 高于Zhao等[11]利用4个mtDNA序列的研究结果, 而与宋晓等[12]的研究结果相似。分析造成本研究中草鱼D-Loop区多态性较高的原因, 与所用群体数及样本数较多有关。对比Zhao等[11]的研究, 其样本数尽管不多, 但其单倍型多样性水平与本文差异不大, 分析采用更多序列片段易于检测到较多突变位点和

图3 草鱼31种单倍型的MP系统树

Fig. 3 MP phylogenetic tree of 31 haplotypes of grass carp