土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定
上传者:林文康|上传时间:2015-05-08|密次下载
土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定
土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定
摘要:为了了解土壤中微生物的种类和特征并从中分离出淀粉酶产生菌,对其进行纯化和培养,并测定其产生的淀粉酶的活性以及对其进行生理生化试验,了解其代谢特征,需要进行一系列的实验,并在此过程中掌握分离纯化微生物、微生物液体培养法、透明圈法测定淀粉酶活力以及生理生化试验的操作方法和原理。主要实验过程如下:从土壤中筛选淀粉酶产生菌后进行复筛,接着进行种子培养,所得发酵液用于淀粉酶活力的测定以及生理生化反应。
关键词:土壤淀粉酶产生菌 分离纯化 发酵培养 透明圈法 生理生化试验 正文:
1、土壤淀粉酶产生菌的分离与纯化
1.1 实验原理
在自然条件下,微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性,或者大量培养和利用某一种微生物,必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株,获得纯培养。获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法,也即是从含有多种杂居在一起的微生物材料中,通过稀释分离、划线分离、单孢子分离等方法,使它们分离成为单个个体并在固定培养基的固定地方繁殖成为单个菌落,从单个菌落中挑选所需纯种。不同微生物可用不同培养基和不同培养条件进行单菌分离获得纯种,纯种再经繁殖培养后,可用于进一步研究形态、生理等欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出,并且取得某种所需微生物的个体进行纯培养,那是困难的。由于微生物可以形成菌落,而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成。不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同的单一菌落,再从选定的某一所需菌落中取样,移植到新的培养基中去,就可以达到分离纯种的目的。这就是纯种分离法的原理。
在微生物的分离和纯种培养过程中,必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作,就是在分离、接种、移植等各个操作环节中,必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器。
淀粉是有葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的直链淀粉组成的。按照水解方式的不同,主要的淀粉酶可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶4大类。产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母等。利用淀粉遇碘变为蓝色的特性,将分离的微生物接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养,利用滴加碘液后菌落周围出现透明圈,未水解的淀粉呈蓝色,
水解圈无色,判断是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
从微生物群体中经分离、生长,在平板上形成的肉眼可见的菌落,不一定是单个细胞生长繁殖而成的,有的可能来自2个或者多个细胞。因此,纯培养的确定观察菌落特征外,还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。甚至有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
1.2 实验器材
1.2.1 材料 土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、PDA培养基、99ml无菌水1瓶(带玻璃珠)、5支9ml无菌水/试管等。
1.2.2 用具 无菌培养基、无菌吸管、无菌水、酒精灯、无菌涂布棒(又名扩散棒、三角棒)、接种环、生物洁净工作台、生化培养箱、人工智能培养箱、手动菌落计数器(SC6)、移液器、移液枪、试管、三角瓶、显微镜等。
1.3 实验过程
1.3.1 土壤稀释液的制备
称取土壤,制备稀释度分别为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。
1.3.2 稀释平板法从土样中分离真菌
先在无菌培养皿中加入稀释度为10-7的土壤稀释液0.2mL,再加入马铃薯培养基,充分混匀铺平并凝固后倒置于28~30℃恒温培养5~6d,培养完成后观察真菌菌落形态。结果如图1所示,培养基上分布有多个菌落,根据颜色判断为有两种真菌,一种正面为青色,背面为肉色,有9个菌落,另一种正面为墨绿色,背面为黑色,有霉味,有3个菌落。
图1 稀释平板法分离真菌结果
1.3.3 平板涂抹法分离土壤中的放线菌
先在无菌培养皿中倒入适量淀粉培养基,铺成平板,凝固后,再加入稀释度为10-7的土壤稀释液0.2mL,用无菌三角玻棒在平板表面涂抹均匀,倒置于28~30℃条件下培养3~4d,观察放线菌菌落形态。结果如图2所示,并没有分离得到单菌落,而只有菌苔,颜色为黄色,有泥腥味。没有出现单菌落可能是操作出现差错,因为稀释度为10-7,并没有偏大,所以可能是操作的问题。
图2 平板涂抹法分离放线菌结果
1.3.4 平板划线法分离土壤中的细菌
先在无菌培养皿中倒入牛肉膏蛋白胨培养基,制成平板,再用分区划线法挑取稀释度为10-2的土壤稀释液一环在平板上划线。划线完毕,盖上皿盖,倒置于28~30℃培养。观察细菌菌落形态,结果如图3所示,有肉眼可见的单菌落,
直径约为3mm,颜色为肉色,有臭味。
图3 平板划线法分离细菌结果
1.3.5 用划线分离法对淀粉酶产生菌进行分离纯化
1.3.5.1 在分离出真菌的马铃薯培养基的平板上滴加碘液,如图4所示,可以看出仅有一个菌落的水解圈较大符合要求,挑取该菌落,在淀粉培养基上进行划线分离,倒置30℃培养。结果如图5所示。
图4 滴加碘液后的马铃薯培养基
图5 淀粉培养基上分离纯化得到的真菌
1.3.5.2 在分离出细菌的牛肉膏蛋白胨培养基上挑取单菌落,在淀粉培养基上进行划线分离,倒置30℃培养,结果如图6所示,有单菌落。
图6 淀粉培养基上分离纯化得到的细菌
1.3.5.3 将淀粉培养基上分离纯化得到的单菌落接种到斜面培养基上,培养至成熟,待用。
1.4 结果与分析
1.4.1 由图1观察可得真菌的菌落特征,本实验中分离得到的为霉菌,有两种,一种正面为青色,背面为肉色,另一种正面为墨绿色,背面为黑色,有霉味,菌落较大且疏松,菌落比较干燥,用接种环挑取菌落时较难,说明与培养基结合牢固。
1.4.2 由图2观察可得放线菌的菌落特征,本实验中没有得到单菌落,为菌苔,比较干燥,颜色为黄色,菌落较小,分布紧密,带有泥腥味。
1.4.3 由图3观察可得细菌的菌落特征,菌落小且突起,直径约为3mm,较湿,颜色为肉色,有臭味,用用接种环挑取单菌落时较容易,说明不与培养基结合。
1.4.4 由图4观察知有一个菌落的水解圈直径较大,为淀粉酶产生菌。
1.5 结论
1.5.1 对土壤中微生物进行分离筛选,观察各种微生物的菌落形态,本次实验结果如表1-1所示。
表1-1 土壤中微生物菌落特征
内容需要下载文档才能查看
1.5.2 在淀粉培养基上分离得到的单菌落,为淀粉酶产生菌,再接种到斜面上进行培养,作为后续实验的材料。
2、淀粉酶产生菌的发酵培养
2.1 实验原理
微生物发酵是生物工程的重要组成和基础。它主要是利用微生物的特定性状,通过现代工程技术进行工业化生产有用物质的技术体系。微生物发酵既是开发生物资源的关键技术,又是生物技术产业化的重要环节。
根据微生物发酵方式的不同,可以将发酵分为固态发酵和液态发酵。固态发酵又称固体发酵,是一种传统的发酵方法,即将发酵的固体原料按一定的比例与一定量水分混合后进行灭菌,然后接种菌种。液态发酵又称为液体发酵,将所用原料配成液体状态,接种菌种进行发酵。液态发酵又可分为浅盘发酵和液体深层发酵。液体深层发酵采用密闭的发酵罐,在罐中进行发酵。
液体发酵大致分为三大工序:种子培养,发酵,提取。
2.2 实验器材
2.2.1 菌种:大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,前期实验分离得到的菌种。
2.2.2 仪器:超净工作台、恒温培养箱、摇床、发酵罐、发酵尾气分析仪、移液器、接种环、酒精灯、记号笔等。
2.2.3 培养基:液体发酵培养基
2.3 实验过程
2.3.1 摇瓶发酵
2.3.1.1 种子培养:取活化好的菌种由斜面培养基转接入盛有30mL种子培养基的250mL锥形瓶内,与转速180-220r/min旋转式摇床上30℃培养1-2天。
2.3.1.2 发酵:吸取培养好的种子液3mL,接入多个盛有30mL发酵培养基的的
内容需要下载文档才能查看
锥形瓶内,于180-220r/min恒温摇床上30℃培养2-3天。
2.3.1.3 提取:取发酵液20mL,平均分配到两个离心管中,12000r/min离心10min,分别收取上清液和菌体,分别保存在冰箱中。
2.3.2 全自动发酵罐的基本了解
全班同学分为两批由老师介绍全自动发酵罐的基本构造和基本操作方法。
2.4 结果与分析
本次实验得到的上清液为黄色,菌体为淡黄色。保留,作为后续试验淀粉酶活性测定及微生物生理化反应的材料。
3、淀粉酶的活性测定
3.1 实验原理
淀粉酶包括几种催化特点不同的成员,其中α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端,生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉浆的粘度下降,因此又称为液化酶;β-淀粉酶每次从淀粉的非还原端切下一份子麦芽糖,又被称为糖化酶。产淀粉酶的微生物在以可溶性淀粉为底物配置的固体培养基生长,其菌落周围的培养基会由白色变成灰色且透明,形成透明圈。在一定浓度范围内,透明圈的直径d与淀粉酶活力的大小(对数值)成正比。以已知浓度的淀粉酶为对照,制作透明圈与淀粉酶活力标准曲线。从样品的透明圈直径大小可在标准曲线上求得其淀粉酶活性大小。由于本方法是直接测定方法,而且灵敏度高,不需要特殊设备,故被广泛采用。
3.2 实验器材
3.2.1 菌种:产淀粉酶微生物
3.2.2 培养基:培养基Ⅱ:培养基Ⅰ加2g/L的可溶性淀粉和2g/L的琼脂,透明圈测定使用。
3.2.3 仪器和其他用具:摇床、恒温培养箱、纸片、移液枪、镊子、淀粉酶标准品、尺子、小试管、容量瓶、离心机。
3.3 实验过程
3.3.1 取取浓度为1mg/mL,2mg/mL,3mg/mL,4mg/mL,5mg/mL,6mg/mL的淀粉标准溶液和样品,滴于纸片上,使用6个培养基,每副培养皿放置4张纸片,置于培养基的方式简单表示如下:
下载文档
热门试卷
- 2016年四川省内江市中考化学试卷
- 广西钦州市高新区2017届高三11月月考政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高一上学期期中考试政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高二上学期期中考试政治试卷
- 辽宁省铁岭市协作体2017届高三上学期第三次联考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2017届高三11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 山东省滨州市三校2017届第一学期阶段测试初三英语试题
- 四川省成都七中2017届高三一诊模拟考试文科综合试卷
- 2017届普通高等学校招生全国统一考试模拟试题(附答案)
- 重庆市永川中学高2017级上期12月月考语文试题
- 江西宜春三中2017届高三第一学期第二次月考文科综合试题
- 内蒙古赤峰二中2017届高三上学期第三次月考英语试题
- 2017年六年级(上)数学期末考试卷
- 2017人教版小学英语三年级上期末笔试题
- 江苏省常州西藏民族中学2016-2017学年九年级思想品德第一学期第二次阶段测试试卷
- 重庆市九龙坡区七校2016-2017学年上期八年级素质测查(二)语文学科试题卷
- 江苏省无锡市钱桥中学2016年12月八年级语文阶段性测试卷
- 江苏省无锡市钱桥中学2016-2017学年七年级英语12月阶段检测试卷
- 山东省邹城市第八中学2016-2017学年八年级12月物理第4章试题(无答案)
- 【人教版】河北省2015-2016学年度九年级上期末语文试题卷(附答案)
- 四川省简阳市阳安中学2016年12月高二月考英语试卷
- 四川省成都龙泉中学高三上学期2016年12月月考试题文科综合能力测试
- 安徽省滁州中学2016—2017学年度第一学期12月月考高三英语试卷
- 山东省武城县第二中学2016.12高一年级上学期第二次月考历史试题(必修一第四、五单元)
- 福建省四地六校联考2016-2017学年上学期第三次月考高三化学试卷
- 甘肃省武威第二十三中学2016—2017学年度八年级第一学期12月月考生物试卷
网友关注
- 中外城市建设史复习大全
- 科学社会主义 各章重点整理
- 我国继承法的完善
- 一国两制
- 赫拉克勒斯
- 教学大纲1
- 03试卷b - 副本
- 2015精华背诵笔记——思修部分(2014.10.6发布)
- 法律与影视
- 金砖之国-印度思考
- 厦门大学《中国近现代史纲要》课程试卷 2
- 大学生爱情观
- 七个铜板
- 161叫感悟-教师的生命信仰
- 商法
- 安娜与国王
- 看看世,想想自己
- “支那”一词的来龙去脉与恩恩怨怨
- 案例分析法大剖析
- 毛泽东思想和中国特色社会主义理论体系概论
- 2014毛概复习提纲2(1)
- 传感器复习提纲(最新)
- 开题报告书
- 毛概分工
- 毛概
- 毛概作业模板 (1)
- 进城务工人员子女融合教育的现状与对策
- 社会史著作
- 湖南科技大学李爱军老师作业
- 马克思学院-周利民-设备商-16
网友关注视频
- 30.3 由不共线三点的坐标确定二次函数_第一课时(市一等奖)(冀教版九年级下册)_T144342
- 沪教版牛津小学英语(深圳用) 五年级下册 Unit 7
- 外研版八年级英语下学期 Module3
- 【部编】人教版语文七年级下册《逢入京使》优质课教学视频+PPT课件+教案,安徽省
- 沪教版牛津小学英语(深圳用) 五年级下册 Unit 12
- 《空中课堂》二年级下册 数学第一单元第1课时
- 3月2日小学二年级数学下册(数一数)
- 飞翔英语—冀教版(三起)英语三年级下册Lesson 2 Cats and Dogs
- 外研版英语三起6年级下册(14版)Module3 Unit1
- 第五单元 民族艺术的瑰宝_16. 形形色色的民族乐器_第一课时(岭南版六年级上册)_T1406126
- 冀教版小学数学二年级下册第二周第2课时《我们的测量》宝丰街小学庞志荣.mp4
- 六年级英语下册上海牛津版教材讲解 U1单词
- 沪教版牛津小学英语(深圳用) 五年级下册 Unit 10
- 苏科版数学 八年级下册 第八章第二节 可能性的大小
- 【获奖】科粤版初三九年级化学下册第七章7.3浓稀的表示
- 沪教版八年级下册数学练习册21.3(2)分式方程P15
- 【部编】人教版语文七年级下册《泊秦淮》优质课教学视频+PPT课件+教案,广东省
- 二年级下册数学第一课
- 【部编】人教版语文七年级下册《逢入京使》优质课教学视频+PPT课件+教案,辽宁省
- 【部编】人教版语文七年级下册《老山界》优质课教学视频+PPT课件+教案,安徽省
- 8.练习八_第一课时(特等奖)(苏教版三年级上册)_T142692
- 七年级下册外研版英语M8U2reading
- 【部编】人教版语文七年级下册《过松源晨炊漆公店(其五)》优质课教学视频+PPT课件+教案,江苏省
- 【部编】人教版语文七年级下册《逢入京使》优质课教学视频+PPT课件+教案,安徽省
- 外研版英语三起6年级下册(14版)Module3 Unit2
- 苏科版八年级数学下册7.2《统计图的选用》
- 北师大版数学 四年级下册 第三单元 第二节 小数点搬家
- 冀教版英语五年级下册第二课课程解读
- 8.对剪花样_第一课时(二等奖)(冀美版二年级上册)_T515402
- 北师大版数学四年级下册3.4包装
精品推荐
- 2016-2017学年高一语文人教版必修一+模块学业水平检测试题(含答案)
- 广西钦州市高新区2017届高三11月月考政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高一上学期期中考试政治试卷
- 浙江省湖州市2016-2017学年高二上学期期中考试政治试卷
- 辽宁省铁岭市协作体2017届高三上学期第三次联考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2017届高三11月月考政治试卷
- 广西钦州市钦州港区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高二11月月考政治试卷
- 广西钦州市高新区2016-2017学年高一11月月考政治试卷
分类导航
- 互联网
- 电脑基础知识
- 计算机软件及应用
- 计算机硬件及网络
- 计算机应用/办公自动化
- .NET
- 数据结构与算法
- Java
- SEO
- C/C++资料
- linux/Unix相关
- 手机开发
- UML理论/建模
- 并行计算/云计算
- 嵌入式开发
- windows相关
- 软件工程
- 管理信息系统
- 开发文档
- 图形图像
- 网络与通信
- 网络信息安全
- 电子支付
- Labview
- matlab
- 网络资源
- Python
- Delphi/Perl
- 评测
- Flash/Flex
- CSS/Script
- 计算机原理
- PHP资料
- 数据挖掘与模式识别
- Web服务
- 数据库
- Visual Basic
- 电子商务
- 服务器
- 搜索引擎优化
- 存储
- 架构
- 行业软件
- 人工智能
- 计算机辅助设计
- 多媒体
- 软件测试
- 计算机硬件与维护
- 网站策划/UE
- 网页设计/UI
- 网吧管理