天麻饮片分级的研究

　　2014年1月

　　第36卷第1期中成药

　　ChineseTraditionalPatentMedicineJanuary2014Vol．36No．1

　　［饮片炮制］

　　1122*1*仲瑞雪，钟恋，万军，周霞，吴纯洁

　　（1．成都中医药大学，四川成都611137；2．西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都610031）

　　摘要：目的结合外在质量与内在质量对天麻饮片进行综合评价，并探索其等级划分的方法。方法通过检测陕西、

　　贵州、四川等三产地天麻饮片的性状、水分、浸出物、天麻素含有量、指纹图谱聚类分析及相似度等指标，并结合市场饮片分级情况，进一步完善天麻饮片的分级标准。结果论

　　关键词：天麻饮片；分级；内在质量；指纹图谱中图分类号：Ｒ282.5

　　文献标志码：A

　　1528（2014）01-0135-06文章编号：1001-doi：10.3969/j．issn．1001-1528.2014.01.033

　　采用“三步分级法”可将天麻饮片划分为三个等级。结

　　“三步分级法”综合评价标准更能准确划分天麻饮片等级，具有一定的参考价值。

　　ClassificationofGastrodiaeＲhizomapieces

　　ZHONGＲui-xue1，

　　ZHONGLian1，

　　WANJun2，

　　ZHOUXia2*，

　　WUChun-jie1*

　　（1．ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu611137，China；2．LifeScience＆EngineeringCollegeofSouth-westJiaotongUniver-sity，Chengdu610031，China）

　　KEYWOＲDS：GastrodiaeＲhizomapieces；classification；intrinsicquality；fingerprint天麻为兰科植物天麻GastrodiaelataBl．的干

　　［1］

　　燥块茎，又名赤箭，主产于陕西、四川、贵州、

　　［2］

　　云南等地。天麻性平、味甘，归肝经，具有熄

　　［3-4］

　　，主要用于治疗头风止痉、平肝潜阳的功能

　　［5-7］

　　。天麻素为其主要的活性物质，痛、眩晕等症

　　［8-14］

　　。目前仅天具有镇痛、降压、解痉等药理作用

　　［15］

　　麻药材有等级划分，而饮片分级标准尚不完善。课题组针对目前市场上天麻饮片等级划分模糊，划

　　GastrodiaelataBl．的干燥块茎，并委托四川新荷花中药饮片有限公司加工为饮片，样品保存于西南交通大学生物工程实验室。天麻素对照品（中国药

　　200205）。乙腈、品生物制品检定所，批号110807-甲醇均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

　　1.2仪器岛津LC-2010A高效液相色谱仪（日

　　本岛津公司）；SartoriusBP211D电子天平（感量0.1mg、0.01mg；载量210g、80g；德国赛多利斯公司）；AutoscienceAS5150A超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；电热式恒温水浴锅（江苏金坛宏凯仪器厂），色谱柱Globalchro-matographyC18（250mm4.6mm，5μm，苏州环球色谱有限责任公司）；实验统计软件为SPSS17.0。22.1

　　方法与结果

　　天麻饮片等级调研课题组成员对四川绵阳平武县、贵州毕节大方县、陕西汉中略阳县、宁强

　　分标准不完善等问题，开展天麻饮片等级的研究，现报道如下。11.1

　　材料与仪器

　　材料本研究所用药材为兰科植物天麻Gast-rodiaelataBl．的干燥块茎，生长期为2～4年，家种，冬麻，样品采收时间为2011年10月至2011年12月，分别购于陕西汉中、四川绵阳、贵州毕节，每批采样10kg。药材经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科教授鉴定为兰科植物天麻

　　03-29收稿日期：2013-

　　：“十二五”重大新药创制科技重大专项（2011ZX09401-028）；国家中医药管理局中医药行业专项（201007012-3-6）；中央高基金项目

　　校基本科研业务费专项资金资助（SWJTU12CX051；2682013CX035）

　　mail：zhongruixue89@http://www.wendangwang.com作者简介：仲瑞雪（1989—），女，硕士生，研究方向：中药炮制与制剂。Tel：15982097294，E-*通信作者：吴纯洁（1965—），男，教授，研究方向：中药炮制与制剂。Tel：（028）61801001，E-mail：wcj-one@

　　周

　　mail：jolly101@http://www.wendangwang.com霞（1980—），女，讲师，研究方向：中药炮制与制剂。Tel：（028）87603202，E-

　　135

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　　县的天麻基地及产地中药饮片厂进行了调研。结果显示，国内天麻药材分级仍沿用1984年的《七十六种药材商品规格标准》按每公斤支数划分等级，对天麻饮片的分级概念却比较模糊，大多数饮片厂并没有对饮片进行分级，只有在客户有分级要求时，才对天麻饮片进行分级加工。2.2

　　天麻饮片片型测定课题组共采集了12批样品。每批样品选择300个样本进行测量，测定结果

　　表1

　　Tab.1

　　编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12

　　由表2可见，各样品中含水量高低排序为S8＞S12＞S2＞S7＞S1=S3＞S11＞S4＞S10＞S5＞S6＞S9，总灰分高低排序为S5=S10＞S6=S11=S12＞S2＞S3=S7=S9＞S4=S8＞S1，75%乙醇浸出物高低排序为S3=S9＞S4=S5=S6＞S8＞S7＞S2＞S1＞S11＞S12＞S10。

　　天麻饮片中天麻素测定

　　2.4.1色谱条件GlobalchromatographyC18色谱柱（250mm4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液（3∶97）；体积流量1.0mL/min；柱温25℃；检测波长220nm；进样量5μL。理论板数按天麻素峰计算应不低于5000。2.4.2对照品溶液的制备精密称取在80℃减压干燥1h的天麻素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1mL含50μg的溶液，即得。2.4.3

　　供试品溶液制备取本品粉末（过三号

　　筛）约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50mL，称定质量，加热回流3h，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，浓缩至近干，残渣加乙腈-水（3∶97）混合溶液溶解，转移至25mL量瓶中。用乙腈-水（3∶97）混合溶液稀释至刻度，

　　摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.4.4

　　线性关系精密称取天麻素对照品50mg，

　　置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；再分别精密吸取对照品溶液1.0、加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线溶液。按上述色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线。回归方程Y=1.49106X+28847.64，r=0.9999，天麻素进样量在0.2～2.0μg范围内与峰面积呈线性关系。2.4.5

　　样品测定分别精密吸取对照品溶液与供

　　试品（样品1～12）溶液各5μL，注入液相色谱

　　2.4.1”项下色谱条件测定，仪，结果见图1，按“

　　按干燥品计算，结果见表3。

　　由表3可见，各样品中天麻素含有量高低为S4＞S3＞S6=S5＞S2＞S1＞S7＞S9＞S8＞S12＞S11＞S10。2.52.5.1

　　天麻饮片指纹图谱研究

　　［16-20］

　　2.4

　　［1］

　　见表1。

　　天麻饮片样品片型测定结果（n=300）Sheet-typemeasurementresultsofGastrodiaeＲhi-zomapieces（n=300）

　　产地陕西陕西陕西陕西陕西陕西四川四川四川贵州贵州贵州

　　市场等级一级一级二级二级三级三级一级二级三级一级二级三级

　　片型纵片纵片纵片纵片纵片纵片横片横片横片横片横片横片

　　长径/mm

　　110～140110～14065～8565～8550～6550～6540～5020～2520～2530～4025～3025～30

　　由表1可见，各样品中片型大小由大到小排序，纵片S1=S2＞S3=S4＞S5=S6；横片S7＞S10＞S11=S12＞S8=S9。

　　天麻饮片水分、浸出物测定按2010年版《中国药典》一部附录水分、总灰分、浸出物测定方法测定，平行测定3份，结果见表2。

　　表2Tab.2

　　天麻饮片样品水分、总灰分、浸出物测定结果（n=3）

　　Moisture，totalashandextractmeasurementre-sultsofGastrodiaeＲhizomapieces（n=3）

　　编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12

　　产地陕西陕西陕西陕西陕西陕西四川四川四川贵州贵州贵州

　　市场等级水分/%总灰分/%一级一级二级二级三级三级一级二级三级一级二级三级

　　11.211.411.211.010.510.311.311.610.110.811.111.5

　　2.32.62.52.42.82.72.52.42.52.82.72.7

　　浸出物（75%乙醇）/%

　　16.716.919.819.619.619.619.219.319.813.916.315.5

　　2.3

　　2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，置25mL量瓶中，

　　供试品溶液制备取本品粉末（过三号

　　筛）约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加

　　入甲醇50mL，称定质量，加热回流1h，放冷，

　　136

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　　ChineseTraditionalPatentMedicine

　　表4Tab.4

　　t/min0～1010～2020～2525～3535～5050～6060～78

　　January2014Vol．36No．1

　　梯度条件

　　Gradientconditions

　　流动相A/%

　　9898～96

　　9696～89

　　8989～82

　　82

　　流动相B/%

　　22～4

　　44～11

　　1111～18

　　18

　　述供试品溶液制备方法和色谱条件进行检测，连续进样6次，以天麻素峰（4号峰）作为参照峰，指

　　1．天麻素1．gastrodin

　　图1Fig.1

　　天麻素对照品（A）及12批天麻饮片（B）的HPLC图谱

　　HPLCchromatogramsofGastrodiaeＲhizomapiecesforreference（A）andtwelvesamples（B）表3

　　天麻饮片样品中天麻素测定结果（n=3）

　　纹图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的ＲSD分别在0.38%～1.03%和0.41%～2.92%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

　　2.5.4.2稳定性试验取同一批天麻样品，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件进行检测，分别在0、2、4、6、8、12h不同时间点进行检测，以天麻素峰（4号峰）作为参照峰，指纹图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的ＲSD分别在0.38%～1.45%和0.79%～2.88%，表明样品在12h内基本稳定。2.5.4.3

　　取同一天麻样品6份，按

　　上述供试品溶液制备方法和色谱条件进行检测，以

　　重复性试验

　　Tab.3GastrodinassayresultsofGastrodiaeＲhizomapieces（n=3）

　　编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12

　　产地陕西陕西陕西陕西陕西陕西四川四川四川贵州贵州贵州

　　市场等级一级一级二级二级三级三级一级二级三级一级二级三级

　　天麻素平均值/%

　　0.710.731.021.030.950.950.300.270.280.220.240.25

　　天麻素峰（4号峰）作为参照峰，指纹图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的ＲSD分别在0.20%～0.66%和1.46%～2.86%。表明本方法重复性良好。

　　2.5.5对照指纹图谱的建立及共有峰的确定

　　将

　　12批天麻样品，按“2.5.1”项下方法制备供试品溶液，按以上色谱条件测定。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A版），以中位数生成指纹图谱共有模式，共确定11个共有峰，结果见图2、3。

　　再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.5.2

　　参照物溶液的制备取天麻素对照品适量，

　　精密称定，加甲醇制成每1mL含100μg的溶液，即得。

　　色谱条件GlobalchromatographyC18色谱

　　柱（250mm4.6mm，5μm）；以0.4%磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按表4中的规定

　　2.5.3

　　进行梯度洗脱；体积流量为1mL/min；检测波长为270nm；柱温25℃；进样量10μL。2.5.4方法学考察2.5.4.1

　　精密度试验

　　取同一批天麻样品，按上

　　4．天麻素4．gastrodin

　　图2

　　Fig.2

　　pieces

　　天麻饮片指纹图谱共有模式图

　　CommonfingerprintsmodeofGastrodiaeＲhizoma

　　137

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　　2.5.6

　　共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积在所建立的色谱条件下，天麻各样品的特征峰均

　　有较好的分离，保留时间较为稳定，同时11个特征峰均能稳定出现，以天麻素（4号峰）为S峰，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表5、6。2.5.7

　　图3

　　Fig.3

　　12批天麻饮片指纹图谱叠加图

　　采用《国家药典》委员会中

　　药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2004A

　　相似度分析

　　HPLCfingerprintsof12batchesofGastrodiaeＲhizomapieces

　　表5

　　Tab.5

　　版），以生成的指纹图谱共有模式为对照计算各批次样品的相似度，结果见表7。

　　12批天麻饮片指纹图谱的相对峰面积

　　相对峰面积

　　60.10090.09200.07840.07280.06970.07050.40320.70460.53790.31080.42600.3196

　　Ｒelativepeakareasof12batchesofGastrodiaeＲhizomapiecesfingerprint

　　30.11870.11220.07780.07480.06990.08900.27850.39880.32870.30260.27680.1829

　　4（S）1.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.0000

　　50.68460.69212.79172.79082.72502.70400.04000.16430.09670.04580.10770.0977

　　70.10060.10460.16620.16650.18400.22190.02160.04980.05280.03960.03610.0333

　　80.41250.40880.29500.29450.25030.31720.31590.39460.39970.23980.49950.4383

　　90.53830.53690.42880.41830.39960.40570.59950.57740.59880.39770.55310.4657

　　100.11790.11720.08780.08850.08490.08430.12620.08850.11040.06460.08850.0736

　　110.67970.70240.38000.44980.36960.38231.40851.02311.06580.73181.20591.0156

　　编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12

　　10.24670.25550.29470.28970.31520.32350.33690.36900.32600.28710.49620.2563

　　20.05250.05080.05070.05100.04880.05650.05260.04600.04320.03140.03230.0259

　　表6

　　Tab.6

　　编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12

　　10.17520.17680.17600.17650.18150.18070.17850.17630.18230.18000.17770.1827

　　20.25190.25360.25190.25320.25760.25690.25470.25220.25850.25810.25440.2591

　　12批天麻饮片指纹图谱的相对保留时间

　　相对保留时间

　　61.55411.54811.53901.54441.55171.55181.55671.55321.56031.57391.56221.5704

　　Ｒelativeretentiontimeof12batchesofGastrodiaeＲhizomapiecesfingerprint

　　30.51120.50820.51210.50740.50640.50640.50290.51100.50480.51050.51360.5117

　　4（S）1.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.00001.0000

　　51.19771.19821.19201.19841.20461.20301.19921.19371.20011.21121.20051.2070

　　72.15912.16972.15392.15982.20102.19502.18562.15872.21002.20782.17602.2216

　　82.32272.33162.31682.32122.36302.35642.34842.32172.37042.37242.33842.3838

　　93.31793.33573.30693.32043.38433.37593.36063.31913.39873.39493.34523.4150

　　103.47703.49843.46783.48183.54943.54183.52563.47903.56743.56063.50663.5851

　　113.75873.77963.74943.76143.83553.82543.80993.75993.85423.84823.78923.8747

　　表7

　　Tab.7

　　编号相似度

　　S10.914

　　S20.916

　　S30.938

　　S40.942

　　12批天麻饮片指纹图谱的相似度

　　S50.935

　　S60.939

　　S70.651

　　S80.689

　　S90.651

　　S100.576

　　S110.685

　　S120.689

　　Samplesimilaritycalculationresultsof12batchesofGastrodiaeＲhizomapieces

　　由表7可知，按样品相似度可将样品分三类，S3～S6为Ⅰ类，相似度在0.93以上，S1～S2为Ⅱ

　　138

　　类，相似度在0.91至0.93之间，其余为Ⅲ类，相似度在0.7以下。

　　2014年1月

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　　2.5.8

　　聚类分析以各样品共有峰的相对峰面积

　　值为变量，利用SPSS17.0聚类分析法，采用组间

　　3.2.1

　　按照药典方法对样品进行检查，

　　符合药典标准的样品均划为统货。实验共收集12

　　第一步

　　距离法，欧氏距离平方作为测度，对12批样品进行分类，结果见图4

　　。个样品，均检验合格，暂定为统货。

　　3.2.2第二步采用传统分级方法，即根据天麻饮片长径进行选优，分出统货和一级及以上。实验共收集12个样品，结合市售天麻饮片实际情况，2个样品划为统货，其余10个样品定为一级及以上。3.2.3第三步在传统分级方法的基础上，进一步考察天麻素含有量、75%乙醇浸出物量、指纹图谱聚类分析及相似度等内在指标，从10个样品选

　　图4Tab.4

　　12批天麻指纹图谱聚类分析

　　Clusteranalysisof34batchesof12batchesofGastrodiaeＲhizomapieces

　　优，共筛选出优级样品4个，其余6个样品定为一级。3.3

　　统计方法对饮片等级的验证运用SPSS17.0软件对“三步法”分出的不同等级的天麻饮片作Kruskal-WallisH检验，结果显示，水分P=0.313，P＞0.05，总灰分的P=0.485，P＞0.05，可认为统货、一级和优级的水分、总灰分含有量没有差异，不能作为分级指标。75%浸出物的P=0.014，P＜0.05，天麻素含有量的P=0.023，P＜0.05，指纹图谱相似度结果P=0.011，P＜0.05，指纹图谱聚类分析结果一级和优级天麻有差异，可认为一级和优级的75%乙醇浸出物含有量、天麻素含有量、指纹图谱有差异，可作为分级指标。

　　统计结果表明，采用“三步法”对天麻饮片分等级可行，具有可操作性及实际应用价值。4

　　结论

　　根据实验结果及“三步法”划分等级，12批市售天麻饮片，S8，S9划分为统货，S1，S2，S7、S10、S11、S12划分为一级，S3～S6划分为优级。分级流程见图5。5

　　讨论

　　本研究结果表明，市场上只按天麻饮片大小分级的方法可能欠妥，课题组提出采用“三步法”划分饮片等级，该方法兼顾了饮片的外在质量和内在质量，为饮片分级提供了一种新方法。按“三步法”划分的优级天麻饮片均来自于道地产区（陕西汉中），说明“三步法”在区分道地性方面有一定适用性。但影响道地性的因素较多，例如栽培环境、采收加工等，因此“三步法”在区分道地性方面是否具有普适性，还需扩大样本进一步考察。本实验所述“三步法”包括的检查项目有限，在此基础上还可增加薄层色谱鉴别、多糖含有量等指标进一步完善分级标准，该方法对市场天麻饮片分级具有一定的参考意义。下一步还应扩大饮片种

　　139

　　由上图可以得出，聚类分析结果大致将样品分为三类，S3～S6为Ⅰ类，S1～S2为Ⅱ类，其余样品为Ⅲ类。根据指纹图谱相似度分析和聚类分析，聚类趋势与相似度计算结果基本一致，两种方法的结果得到了相互验证。33.1

　　结果

　　现有分类法的矛盾本研究中12个样品按片型大小排序，最大为S1、S2、S7，最小为S8、S9；

　　按水分含有量高低排序，最高为S8，最低为S9；按总灰分含有量高低排序，最高为S5、S10，最低为S1；按浸出物含有量高低排序，最高为S3、S9，最低为S10；按天麻素含有量高低排序，最高为S4，最低为S10。经调研，现有天麻饮片分级方法单纯采用片型大小来划分，可能会出现较大片型直接被划分为市场一级饮片而其水分、总灰分、浸出物、天麻素含有量并不是最优，如S1、S2、S10市场等级都是一级，水分含有量分别为11.2%、11.4%、10.8%，总灰分含有量分别为2.3%、2.6%、2.8%，浸出物含有量分别为16.7%、16.9%、13.9%，天麻素含有量分别为0.71%、0.73%、0.22%，均不是最优。因此，如只按饮片大小划分等级，可能会出现外在质量与内在质量不统一的矛盾。目前，天麻饮片分级还没有统一的行业标准。

　　3.2“三步分级法”划分天麻饮片等级

　　为解决

　　上述矛盾，同时结合市场实际情况，课题组创新采）确定饮用“三步分级法”（以下简称“三步法”

　　片标准，即“一步定统货、二步定一级、三步定，结合天麻饮片具体分级方法如下。优级”

　　2014年1月

　　第36卷第1期中成药

　　ChineseTraditionalPatentMedicineJanuary2014Vol．36No．1

　　图5

　　Tab.5

　　天麻饮片分级流程图

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