人参及西洋参栽培土壤微生物种群遗传多样性的RAPD分析_李勇

中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第41卷第11期2010年11月#1871#

#药材与资源#

人参及西洋参栽培土壤微生物种群遗传多样性的RAPD分析

李 勇,应益昕,赵东岳,晋 森,丁万隆*

(中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京 100193)

摘 要:目的 研究不同年生人参、西洋参栽培土壤中微生物种群结构差异。方法 采用RAPD技术对采集自吉林省抚松县的18份人参、西洋参根际土和根围土中的微生物种群结构进行遗传多样性分析。结果 栽培年限对根际土及根围土中的微生物种群结构有显著影响;人参和西洋参栽培土壤中的微生物种群结构也存在差异;寄主植物对土壤微生物种群结构的影响表现有根际效应。结论 人参或西洋参根系分泌物对土壤微生物的定向选择压力可能是造成土壤微生物种群遗传多样性变化的主要原因之一,人参或西洋参栽培土壤中微生物种群结构变化是导致土壤生态功能紊乱以及连作障碍形成的关键因子。

关键词:人参;西洋参;栽培土壤;微生物种群;遗传多样性;RAPD

中图分类号:R28217 文献标识码:A 文章编号:0253-2670(2010)11-1871-05

GeneticdiversityanalysisonrhizospheresoilmicrobialpopulationofPanaxginseng

andPanaxquinquefoliumbyRAPD

LIYong,YINGY-ixin,ZHAODong-yue,JINSen,DINGWan-long

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,

Beijing100193,China))

Abstract:Objective Tostudyrhizosphereandnon-rhizospheresoilmicrobialpopulationgeneticdiversityofPanaxginsengandP1quinquefoliumwithdifferentgrowingyears1Methods EighteenP1ginsengandP1quinquefoliumrhizosphereandnon-rhizospheresoilsampleswerecollectedfromFusongcountyofJilinProvince,andgeneticdiversityofmicrobialpopulationconstructionwereanalyzedbyRAPD1Results Cultivationtimeshavegreatinfluenceonmicrobialpopulationconstructionofrhizosphereandnon-rhizospheresoil1Alsowefoundthatthereweredifferencesbetweensoilmicrobialpopulationcon-structionofP1ginsengandP1quinquefolium1Furthermore,rhizosphereeffectofplantsonsoilmicrobialpopulationconstructionwasalsofound1Conclusion DirectionalselectionpressurethatrootsecretionsofP1ginsengandP1quinquefoliumtosoilmicroorganismsisoneofthemaindrivesthatresultedinthechangeofmicrobialpopulationgeneticdiversity,andmicrobialpopulationconstructionchangeinP1gin-sengandP1quinquefoliumcultivatedsoilisthekeyfactorforsoilecologicalfunctionturbulenceandthedevelopmentofcontinuouslycroppingobstacle1

Keywords:PanaxginsengC1A1Meyer;PanaxquinquefoliumL1;cultivatingsoil;microbialpopu-lation;geneticdiversity;RAPD

人参PanaxginsengC1A1Meyer系我国传统

名贵中药材,在生产中存在较为严重的连作障碍

问题,栽过人参的土地(俗称老参地)30年内不能重

复栽参,否则易出现严重的/烧须、烂根、病害高发0

等问题,严重者甚至造成绝收。西洋参与人参同为

¹ 收稿日期 :2010 -03 -21 [1]五加科人参属药用植物,在生产中也存在连作障碍问题。针对人参、西洋参连作障碍问题,已从土壤理化性状[2]、营养成分[3]、土壤酶活性[4]、土壤微生物区系[5]、病菌积累[6]、化感作用[7]等方面开展了大量研究,但其形成机制迄今尚不明确。根据对人参连基金项目:国家自然科学基金资助项目(30672619);高校博士点科研基金资助项目(200800231060)

作者简介:李 勇(1976)),男,河北省衡水市人,博士,副研究员,主要从事药用植物分子生物学及病害生物防治技术研究,已发表论文30

余篇。Tel:(010)62899745 E-mail:liyong@implad1ac1cn* w1

#1872#中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第41卷第11期2010年11月

表1 供试土壤样品Table1 Soilsamples

编号参龄123456789

土壤样品

备注编号参龄AABBAAAAA

101112131415161718

566332244

土壤样品 2+3年生人参根围土3+3年生人参根际土3+3年生人参根围土3年生西洋参根际土3年生西洋参根围土2年生西洋参根际土2年生西洋参根围土1+3年生西洋参根际土3年生西洋参根围土

备注AAAAAAAAA

作障碍的研究结果,通过轮作、土壤消毒、土壤改良、病害生物防治等[8-9]手段开展了人参、西洋参连作障碍的消除试验,尽管取得了初步成效,但人参、西洋参连作障碍并未彻底消除。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,其在物质与能量循环、土壤结构保持、土壤微生态平衡等方面发挥重要作用。土壤微生物种群多样性是评价土壤微生态环境变化的重要指标,开展老参地土壤微生物种群结构研究,对于阐明人参栽培土壤中微生物种群遗传多样性及群落结构功能在土壤微生态平衡保持中的作用意义重大。

土壤微生物传统分析方法建立在菌物培养的基础上,受多种因素制约,可培养的微生物仅占土壤微生物总数的极小比例(1%~5%)。因此,借助传统的菌物培养方法难以真实、客观地反映土壤微生物种群结构。随着科学技术的进步,许多基于高通量组织培养(如BIOLOG)、化学分析(如PLFA)以及PCR扩增(如DGGE、T-RFLP)等现代生态学研究方法不断涌现,并成功应用于土壤微生物遗传多样性、物种鉴定、系统进化、生态功能分析等研究领域。随机扩增多态性DNA标记(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)是用于土壤微生物种群分析的有效方法之一,其具有操作简单、费用低廉、通用性好等优点;RAPD引物能够与土壤微生物基因组DNA特定位点随机结合,从而达到扫描微生物全基因组的目的。该方法自创建至今,已被广泛应用于动物、植物及微生物基因组水平的遗传多样性研究。本研究在前期的基础上,利用RAPD方法对采自人参、西洋参生产基地的根际土及根围土微生物种群开展了遗传多样性研究;另外,通过比较不同年生人参及西洋参根区土壤微生物种群结构差异,探讨了人参栽培过程中土壤微生物种群结构的特征性变化,为深入研究人参连作障碍的形成机制奠定理论基础。1 材料与方法

111 土壤样品:供试土壤样品共计18份,均采自吉林省抚松县新屯镇黄泥村(北纬42b31c5412d,东经127b15c4518d,海拔58116m)。供试土壤样品均为农田土,土壤类型为黄土,分别采自人参、西洋参的根际及根围(表1)。每份土壤样品均通过多点取样获得,取后直接装入自封袋,采回土样随即用试剂盒(OMEGA)进行了土壤微生物基因组DNA的提取,提取步骤参照试剂盒说明操作,提取的基因组总-,[16-18]

[13-15]

[11-12]

[10]

11年生人参根际土11年生人参根围土11年生人参根际土11年生人参根围土33年生人参根际土33年生人参根围土43+1年生人参根际土43+1年生人参根围土52+1年生人参根际土

A-未改良土壤;B-农家肥改良土壤

A-soilunimproveod;B-soilimprovedbyfarmyardmanure

112 土壤微生物RAPD分析:土壤微生物总DNA

提取及RAPD反应体系参考文献方法[19]。PCR反应体系为25LL,包括1719LL超纯水(ddH2O),215LL10@PCR缓冲液(100mmol/LTris、500mmol/LKCl、20mmol/LMg,pH813),115LLRAPD引物(10Lmol/L);115LLdNTP(215mmol/L),016LLTaqDNA聚合酶(215U/LL),1LL模板DNA(约15ng)。本实验利用从200条RAPD引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的24条RAPD引物(表2),对样品中的土壤微生物种群进行了遗传多样性分析。

PCR反应在BIOMETRATGRADIENT96型扩增仪上完成。扩增程序为:94e、1min,94e、1min,37e、1min,72e、115min,40个循环;最后,72e延伸7min。扩增产物经115%琼脂糖凝胶电泳及EB染色处理后,在BIO-RAD紫外凝胶成像仪上观察、拍照。113 数据采集及分析:根据RAPD扩增产物的电泳结果,在迁移位置相同的琼脂糖凝胶上无DNA条带记为/00,有DNA条带记为/10。用POPGENEVer-sion1131软件计算多态位点百分率、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Neics基因多样性指数(He)、Shannon信息指数(I)。用NTSYSpcVersion2110e软件中的非加权平均数(unweightpair-groupmethodusingarithmeticaverages,UPGMA)方法对统计数据进行聚类分析。2 结果与分析

211 土壤微生物RAPD扩增评价:以试剂盒纯化的土壤微生物基因组DNA为模板,经PCR扩增,共扩增出359条清晰、可辨的RAPD扩增条带,其中多态性条带324条,多态性率高达90125%,扩增片段的长度为200~900bp。每条RAPD引物扩增DNA2+

中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第41卷第11期2010年11月

表2 用于微生物遗传多样性分析的RAPD引物

Table2 RAPDPrimersusedinanalysisofsoilmicrobialpopulationgeneticdiversity

引物OPH8OPH10OPH11OPI4OPJ1OPJ4OPJ7OPJ8OPR7OPR8OPR9OPR10

序 列5c-GAAACACCCC-3c5c

-CCTACGTCAG-3c5c-CTTCCGCAGT-3c5c-CCGCCTAGTC-3c5c-CCCGGCATAA-3c5c-CCGAACACGG-3c5c-CCTCTCGACA-3c5c-CATACCGTGG-3c5c-ACTGGCCTGA-3c5c-CCCGTTGCCT-3c5c-TGAGCACGAG-3c5c-CCATTCCCCA-3c

GC/%60

6060706070606060706060

引物OPR11OPR14OPR16OPR17OPR19OPS4OPS6OPS10OPT16OPT17OPT18OPT19

序 列

5c-GTAGCCGTCT-3c5c-CAGGATTCCC-3c5c-CTCTGCGCGT-3c5c-CCGTACGTAG-3c5c-CCTCCTCATC-3c5c-CACCCCCTTG-3c5c-GATACCTCGG-3c5c-ACCGTTCCAG-3c5c-GGTGAACGCT-3c5c-CCAACGTCGT-3c5c-GATGCCAGAC-3c5c-GTCCGTATGG-3c

#1873#

GC/%60

6070606070606060606060

1315条多态性条带。其中,RAPD引物OPJ1扩增出的多态性条带最多(23条),RAPD引物OPR8扩增出的多态性条带最少(7条)。图1为RAPD引物OPR11在18份土壤微生物样品中的扩增图谱。琼脂糖凝胶电泳结果表明,筛选出的24条RAPD引物可在土壤样品间扩增出丰富的多态性条带,能够用于供试土壤的微生物种群遗传多样性分析。

品的微生物种群间存在较丰富的遗传变异。见表3。213 基于微生物种群遗传多样性的聚类分析:根据18份土壤样品的微生物种群和359个RAPD扩增位点的原始统计数据矩阵,经NTSYSpcVersion2110e软件分析,共获得153个两两比较的遗传相似系数,最大值为018457,最小值为015278。以0165为阈值可以将18份土壤样品划分为6组,见图2。组Ñ包括8份土壤样品,其中土壤样品1和样品2、3和4为直播1年生人参,4份土壤样品中的微生物种群遗传相似系数最高;样品7和样品8对应4(3+1)年生人参,由于经过人工移栽,在新土壤环境中实际仅生长了1年,他们与土壤样品1~4的遗传相似系数也较高。另外,该组还包括与土壤样品15和16对应的直播2年生西洋参。组Ò包括4份土壤样品,分别对应5(2+3)年生人参根际土、6(3+3)年生人参根际土、4(1+3)年生西洋参根际土和6(3+3)年生人参根围土。尽管4份土壤样品对应不同的人参种,生长年限也不相同,但仔细研究发现,他们均在新移栽土壤中

图1 RAPD引物OPR11在18份土壤微生物样品中的

扩增图谱

Fig11 RAPDProfilesofeighteensoilmicrobialsamples

amplifiedbyOPR11

生长了3年,其微生物种群结构也最接近。组Ó包括

2份土壤样品,分别对应直播3年生西洋参根际土和直播3年生西洋参根围土。组Ô仅有4(1+3)年生人参根围土1种。组Õ包括2份土壤样品,分别对应直播3年生人参根际土和直播3年生人参根围土。组Ö也仅有5(2+3)年生人参根围土1种。从上述聚类结果不难发现,栽培年限对土壤中的微生物种群结构的影响最显著;其次,植物的种类对土壤微生物种群也有影响。尽管人参和西洋参同为五加科人参属植物,但从分类学的角度讲,他们属于不同的种,组Ó和组Õ中土壤微生物种群的遗传差异说明,即使是近缘植物,土壤微生物种群结构也可能存在差异。另外,根据相同参龄的人参(或西洋参)根际土和根围土聚类分析结果,植物对土壤微生物种群结构的影响表现212 微生物种群遗传多样性分析:Ne和He是遗传多样性研究中最常用的衡量指标,具有重要的遗传学意义[20-22]。I本身没有遗传学意义,但方便与同类研究进行比较。利用POPGENVersion1132软件对土壤微生物种群遗传多样性分析结果表明,18份土壤样品的平均Na为119753,平均Ne为114463,平均He为012776,平均I为014335。就不同土壤样品而言,其土壤微生物种群的遗传多样性存在较大差异,Ne最大值为116502,最小值仅为112738;He最大值为013666,最小值为011980;I最0

#1874#中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第41卷第11期2010年11月

表3 18份土壤样品的微生物种群遗传多样性分析Table3 Geneticdiversityanalysisof18soilmicrobialsamples

RAPD引物OPH08OPH10OPH11OPI04OPJ01OPJ04OPJ07OPJ08OPR07OPR08OPR09OPR10OPR11OPR14OPR16OPR17OPR19OPS04OPS06OPS10OPT16OPT17OPT18OPT19总计

总条带数

11101622242116181371515161514171617151511131012359

多态性条带

11 8 16 21 23 20 16 18 13 7 15 14 12 12 10 11 14 15 15 14 9 12 9 9 324

多态性率/%

100 80 100 95 96 95 100 100 100 100 100 93 75 80 71 65 88 88 100 93 82 92 90 75 90

Ne

113858?012093116053?013121113288?012740115420?012913114448?012850112738?012101114452?013306114165?012677113321?013118114001?013155112760?012082113328?012617113178?012249116502?013304115762?013458116091?012925115889?013357114923?013282114567?013195114937?012700114473?012974115978?012868115771?012516116150?013659114463?013102

He

012642?011034

013542?011358012219?011339013287?011287012815?011425011980?011097012748?011568012727?011204012175?011493012571?011503012003?011066012284?011181012232?011161013666?011518013344?011605013574?011296013412?011525012974?011618012823?011558013094?011273012842?011387013548?011209013517?011014013466?011728012776?011470

I

014274?011250

015297?011617013671?011676015006?011540014382?011876013389?011415014297?011955014355?011427013575?011894014103?011879013430?011366013798?011422013718?011490015392?011888015009?012000015337?011552015104?011876014528?012145014361?012056014781?011551014457?011734015321?011433015317?011147015086?012304014335?01186

相似系数

图2 18份土壤微生物样品的UPGMA聚类图Fig12 UPGMADendrogramof18soilmicrobialsamples

3 讨论

目前,用于研究土壤微生物种群遗传多样性的分子生态学研究方法较多,如DGGE/TGGE、SS-CP、T-RFLP、ARDRA等。但是从研究技术自身特点而言,AFLP和RAPD的扩增条带最为丰富、引物的结合位点随机,能够对土壤微生物全基因组进行扫描,最适合开展土壤微生物种群研究。AFLP,,酰胺凝胶电泳,能够对扩增产物进行高效分离,是研究土壤微生物种群遗传多样性的首选。但该方法建立在限制性酶切的基础上,土壤微生物DNA提取物中的腐殖酸严重限制了该项技术在土壤微生态学研究中的应用[23];另外,AFLP酶切时需要DNA模板的量较多(\100ng),如果微生物DNA提取量不够大,土壤中的非优势微生物种群将很难被发[24]

中草药 ChineseTraditionalandHerbalDrugs 第41卷第11期2010年11月

不如AFLP,但该方法对微生物DNA模板的质量和数量要求较低,在熟练掌握PCR扩增技术,严格控制反应条件和扩增体系的基础上,试验结果的稳定性能够得到保证。

土壤微生物是土壤的重要组成部分,土壤微生物种群结构多样性与土壤养分循环、土壤微生态平衡、土壤理化性状保持等密切相关。本研究尝试从土壤微生物种群遗传多样性变化的角度研究人参栽培过程中人参栽培土壤中微生物种群结构改变与土壤微生态环境恶化的关系。研究结果表明,不同栽培年限人参或西洋参根际土及根围土中的微生物种群结构均存在显著差异,而且不同土壤样品中的微生物种群结构在一定程度上表现有根际效应。

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川产麦冬野生资源HPLC指纹图谱及化学模式识别研究

刘 江,陈兴福,杨文钰,张树平,杜 刚,刘卫国

(四川农业大学农学院,四川雅安 625014)

摘 要:目的 建立川产麦冬野生资源的化学模式识别方法。方法 采用高效液相色谱法,建立川产麦冬野生资

源的HPLC指纹图谱,使用SPSS1710软件对26批不同来源川产麦冬样品的HPLC指纹图谱进行主成分分析,在主成分得分系数矩阵的基础上,对其进行系统聚类分析;并使用相似度评价软件进行相似度评价验证。结果 26批麦冬样品共提取出4个主成分,被分为4大类;与共有峰直接聚类相比,主成分-聚类分析更符合相似度评价结果。结论 利用SPSS软件对麦冬HPLC指纹图谱进行主成分-聚类分析,所建立的模式识别方法,操作简便,统计结果具有可靠性,可对麦冬化学计量学分类及其质量评价提供有效参考。

¹ 收稿日期 :2010 -02 -12

*

基金项目:四川省育种攻关项目/特色种质资源收集整理与创新利用0(2006yzgg12-12)

作者简介:刘 江(1986)),男,四川江油人,硕士研究生,主要从事药用植物生理生态与栽培研究。*