山东牡丹黑斑病的病原菌鉴定与ITS序列分析

园艺学报，2015，42 (3)：585–590.

Acta Horticulturae Sinica doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0545；http：//www. ahs. ac. cn 585 山东牡丹黑斑病的病原菌鉴定与ITS序列分析 石良红，赵兰勇*，吴 迪，王 玉，姜 琳，杨 暖

（山东农业大学林学院，山东泰安 271018）

摘 要：牡丹黑斑病的致病菌尚不明确。通过对泰安地区的牡丹病叶进行组织分离，利用分子生物

学技术结合形态学方法对病原菌进行鉴定，并利用Mega5软件对链格孢属的22个种进行系统发育树分析，

进一步明确其分类地位。结果表明：该病致病菌ITS序列与GenBank中登录的Alternaria alternata、A.

tenuissima、A. metachromatica相似性均为100%，利用DNAMAN软件对核苷酸一致性进行比较，发现样

品菌株与A. alternata的一致性最高，结合形态学方法鉴定该病致病菌为链格孢A. alternata（GenBank登

录号为：KJ682317）。回接鉴定后分离得到的菌株，菌饼刺伤接种的病叶与无伤接种的病叶均发病，但刺

伤叶片病斑扩展快。

关键词：牡丹；黑斑病；链格孢；ITS序列分析；鉴定

中图分类号：S 685.11 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）03-0585-06

The Identification and Analysis of ITS Sequence on Tree Peony Black Spot in Shandong

SHI Liang-hong，ZHAO Lan-yong*，WU Di，WANG Yu，JIANG Lin，and YANG Nuan

（College of Forestry，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

Abstract：The pathogens of tree peony black spot remained unclear. The aim of this research was to clarify its taxonomic status by identifying the pathogen of tree peony black spot. In this study，the pathogen was identified based on morphology and molecular identification，the ITS phylogenetic trees was generated with the soft of Mega 5. The result suggested that the pathogen of tree peony black spot was Alternaria alternate（Genbank Accession No. KJ682317）. The homology between the sample strain and A. alternate was up to 100 percent. The wound leaves and the intact ones were both infected by the pathogen. However，the expansion rate of the disease spot on the wound leaves was faster than the intact ones.

Key words：tree peony；black spot；Alternaria alternata；analysis of ITS sequence；identification

近年来，中国牡丹种植面积不断扩大，牡丹病害日趋严重，其中牡丹黑斑病就是其中之一。发病时叶片出现灰黑色近圆形病斑，有黑色霉状物产生，严重时造成叶片穿孔，脱落，对植株生长造成极大危害（段亚冰，2009）。目前，对该病研究不多，只有简单的病征记录和防治研究，对致病菌只是模糊地描述为链格孢属（Alternaria）真菌（栾飞，2011），尚无明确结论，这对病害预测预报和防治工作造成障碍。

收稿日期：2014–09–12；修回日期：2015–01–27

基金项目：山东省农业良种工程项目（[2012]213号）

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：sdzly369@http://wendang.chazidian.com；Tel：0538-6132011）

Shi Liang-hong，Zhao Lan-yong，Wu Di，Wang Yu，Jiang Lin，Yang Nuan.

The identification and analysis of ITS sequence on tree peony black spot in Shandong.

586 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：585–590.

本研究中结合牡丹黑斑病致病菌形态学和致病性鉴定，利用分子生物学手段对病原菌进行科学鉴定，首次明确了病原菌种类及其分类地位，为防治工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病样的采集和病原菌的分离纯化

2013年5—8月自山东农业大学（泰安）牡丹种质资源圃，采集包括‘冠世墨玉’、‘豆绿’等10个牡丹品种的病叶样品106个。病原菌分离纯化采用常规组织分离法（方中达，1998）。剪切病叶的病健交界处组织使其成2 ~ 3 mm的小块，用75%酒精消毒后，用10%的次氯酸钠溶液浸泡10 min，再用灭菌水漂洗3次后接种在PDA培养基上。每皿接种5块，25 ℃下培养。将长出的菌落进行纯化，纯化后的菌落放在4 ℃冰箱中保存。

1.2 病原菌形态学鉴定

将分离得到的菌株接种在PDA养基上，观察记录菌落的颜色、形状、表面特征、生长速度、边缘生长状况。在电子显微镜下观察孢子的类型、着生方式、大小、颜色、分生孢子梗的特征等。

1.3 病原菌致病性鉴定

2014年4月，‘豆绿’、‘绿绣球’、‘玉版白’、‘红珠女’和‘黑海撒金’牡丹新叶长出后，采集健康嫩叶，先用无菌水洗净，再经75%酒精消毒，无菌水冲洗后晾干备用。将滤纸、培养皿高压灭菌，培养皿内铺一层滤纸，加入灭菌去离子水，浸湿滤纸以便保湿。

针刺接种：用消毒针头刺伤叶片，用直径0.7 cm的打孔器取得菌饼，菌丝面紧贴在叶片伤口处。每叶接种3块菌饼，每品种重复处理9个叶片。每品种接种3组无菌培养基块作为对照。接种1 d后开始观察发病症状，3 d后移开菌丝块，记录病斑大小和颜色。

无伤口接种：处理方法与针刺接种的唯一区别是：不刺伤叶片，其他操作完全相同。

待接种后的叶片发病后，按照柯赫氏法则，重新分离纯化，观察所得分离物与接种菌是否相同。

1.4 病原菌分子生物学鉴定

将分离得到的菌株培养10 d左右，用玻璃片刮取菌丝，在60 ℃烘箱中烘干后采用改良CTAB法提取基因组DNA（苏美和，2013），置–20 ℃冰箱保存备用。

采用的真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′），由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。PCR反应采用25 µL体系：2× Es Taq

，ddH2O 6.5 µL。MasterMix 12.5 µL，菌株总DNA 2 µL，引物ITS1和ITS4各2 µL（10 µmol · L-1）

PCR反应条件：预变性94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保温（修建冰，2013）。

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，DNA片段经Axy PrepDNA凝胶回收试剂盒回收，回收产物进行测序。

测序结果与GenBank登录的22个种的的链格孢属的序列进行同源性对比分析，利用Mega5软件中邻接法（neighbour-joining methods，NJ）构建聚类分析树状图，分析该菌与同属其他菌株的亲缘关系，以确定其分类地位。

石良红，赵兰勇，吴 迪，王 玉，姜 琳，杨 暖.

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园艺学报，2015，42 (3)：585–590. 587 2 结果与分析

2.1 牡丹黑斑病疑似病株的田间症状

田间调查时发现，该病主要危害牡丹叶片（图1，A），在叶片上形成近圆形的病斑，有轮纹但不明显，灰黑色，中间颜色较浅，呈灰白色。田间湿度较大时，叶片表面会出现黑色霉层。该病在田间扩展较慢，在8—9月时达到发病高峰，发病严重时可造成叶片穿孔、脱落，甚至整株死亡。

2.2 牡丹疑似病株样本的形态学观察

分离培养得到373个真菌菌落，其中杂菌菌落48个，325个为疑似病原菌菌落，依次编号为AA1 ~ AA325。325个疑似病原菌菌落的形态特征为正面初为白色，后渐变为暗青褐色，边缘白色，背面有同心轮纹，暗褐色至黑色（图1，B）。菌落生长较快，菌落的平均生长速度 =（菌落直径–原菌碟直径）/天数（刘宝军，2009），菌落的平均生长速度为0.87 cm · d-1。分生孢子梗暗褐色，单生或数根丛生，有分支，直立或弯曲，顶生分生孢子，随着连续产孢作合轴式延伸。分生孢子单生或链状着生，卵形，长椭圆形或倒棍棒形，淡褐色，1 ~ 4个纵、斜隔膜和3 ~ 8个横隔膜，分隔处略隘缩或不隘缩（图1，C）。将病原菌的以上特征与《中国真菌志第十六卷》链格孢属真菌进行对比（张天宇，2003），确定该病原菌为Alternaria alternata。

图1 牡丹黑斑病田间症状与病原菌形态学观察

A1、A2：牡丹黑斑病疑似病株田间症状；B1、B2：病原菌菌落的形态学观察；C1、C2：病原菌孢子及孢子梗；

D1、D2：接种3 d后叶片发病情况。

Fig. 1 The suspected field symptoms and morphological characteristics of Tree Peony Black Spot

A1，A2：The suspected field symptoms of Tree Peony Black Spot；B1，B2：Morphological characteristics offungal colonies；C1，C2：Verticillate

conidiophores of pathogen；D1，D2：Symptoms of tree peony 3 days after inoculation leaves.

2.3 病原菌致病性

选AA1、AA26、AA28、AA47、AA76、AA89、AA113、AA141等8个典型的致病菌，进行致病性鉴定。菌丝块针刺接种法接种的牡丹叶片，接种1 d后开始发病，形成大小为2 ~ 3 mm的黑色圆形病斑。病斑扩展较快，大约6 ~ 8 d可以布满整个叶片。菌丝块无伤口接种法接种的牡丹叶片，1 d后叶片与菌饼接触处有针头状黑色小点出现，随后病斑逐渐扩大，扩展速度与针刺接种的差异

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588 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (3)：585–590. 逐渐减小（图1，D）。对照处理的叶片不出现发病症状。说明病原菌没有伤口的条件下也可以侵染植物，伤口可以促进病原菌的侵染和扩展。用来接种的5个牡丹品种的叶片发病时间及侵染速度没有大的差异，即对病原菌的抗性没有差异。根据科赫式法则将病斑重新进行组织分离，得到的病原菌与接种菌一致，证明该菌为牡丹黑斑病的致病菌。

2.4 牡丹疑似病株样本的分子生物学检测

2.4.1 病原菌分离物rDNA序列扩增

以供试菌株AA1的DNA为模版进行PCR

扩增，得到约530 bp左右的rDNA，经琼脂糖

凝胶电泳检测获得清晰条带（图2），测序后得

到的序列提交至GenBank获得登录号

KJ682317。通过BLAST对比分析，表明该序

列与GenBank中登录的A. alternata、A.

tenuissima、A. metachromatica相似性均为

100%。

2.4.2 序列分析

将样品序列与在GenBank数据库中记录的

Alternaria属22种，利用Mega5软件中邻接法（neighbour-joining methods，NJ）构建聚类分析树状

A. tenuissima、A. ochroleuca、图。如图3所示，可将链格属分为6个聚类组，样品序列与A. alternata、

A. metachromatica的同源性最高，

聚为一个分枝。利用DNAMAN

软件将样品菌株与链格孢属22种真菌的核苷酸一致性进行比对列表（表1），发现样品菌株与A. alternata的一致性最高，一致性的大小与进化树中种间的亲缘关系相一致。在形态学鉴定中发现该菌的分生孢子分隔处略缢缩或不缢缩，可形成简单的树状分支孢子链，进一步鉴定该病原菌为A. alternata，链格孢目链格孢属链格孢。

图2 引物ITS1／ITS4对牡丹黑斑病菌的扩增结果 Fig. 2 PCR amplification of the rDNA ITS1 and ITS4 regions from the sample strain

图3 样品菌株与链格孢属22种真菌的ITS序列聚类分析树状图

Fig. 3 The clustering analysis tree of sample strains and 22 kinds of Alternaria ITS sequences

石良红，赵兰勇，吴 迪，王 玉，姜 琳，杨 暖.

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表1 样品菌株与链格孢属22种真菌序列一致性比较

Table 1 The consistency comparison table of sample strains and 22 kinds of Alternaria ITS sequences

分离物名称

Name

A. alternata

A. metachromatica

A. ochroleuca

A. tenuissima

A. cucumerina

A. brassicae

A. phragmospora

A. tomato

A. consortialis

A. cheiranthi

A. citrimacularis 分离地点 登录号 一致性/% 分离物名称 Location Number ConsistencyName 突尼斯Tunisia JF802118 98.48 A. dianthicola 巴基斯坦Pakistan KF496083 97.56 A. nobilis 中国China FJ426387 96.68 A. malorum 中国China JX406514 95.42 A. porri 美国USA GU983657 90.15 A. cinerariae 美国USA GU983660 86.09 A. panax 突尼斯Tunisia KF417585 78.65 A. perpunctulata 美国USA KF699492 37.34 A. iridis 沙特阿拉伯Saudi Arabia HG798713 35.73 A. gossypina 荷兰Netherlands KC584107 35.54 A. rhadina 美国USA JQ646407 35.52 A. vaccariicola 分离地点 登录号 一致性/% Location Number Consistency荷兰Netherlands KC584113 34.19 美国USA JQ646385 33.83 美国USA JQ646369 33.71 韩国Korea JF331539 33.33 荷兰Netherlands KC584109 33.33 荷兰Netherlands KC584128 33.10 美国USA JQ646227 31.78 美国USA JQ646210 30.58 美国USA JQ646202 29.33 美国USA JQ646204 29.18 美国USA JQ646190 26.93 3 讨论

牡丹黑斑病发生较为普遍，田间发病率可达40%左右。目前国内对牡丹黑斑病的研究主要集中在发病症状和药剂防治试验等，国外对该病几乎没有研究，病原菌具体种尚未明确（杨瑞先 等，2010；徐擎 等，2012）。由于链格孢属真菌形态极为相似，且小孢子种间序列相似性较高，需要多种方法结合才能对病原菌进行准确鉴定。本研究中采用分子生物学与传统形态学方法相结合，利用ITS序列分析对病原菌的5.8S区、ITS1区、ITS2区，18S和28S区部分序列进行精确的对比分析，首次对该病病原菌进行准确鉴定。该序列与A. alternata、A. tenuissima、A. metachromatica相似性均为100%，说明仅通过ITS序列分析不能将链格孢属小孢子种区别开（王义勋 等，2006），经过核苷酸序列一致性比较，该序列与A. alternata一致性最高，参考形态学鉴定中分生孢子的形状与着生方式，最终确定该致病菌为A. alternata。ITS序列分析通过核苷酸序列一致性比较可以准确反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，为植物病原的快速准确鉴定提供了分子方面的依据（赵杰，2004；高永洋 等，2009），但由于Alternata属ITS区序列相似性较高，故需结合传统形态学对病原菌进行全面鉴定。致病性鉴定发现，该病菌在自然无伤的条件下可以侵染植物叶片，伤口有利于病原菌的侵染。随着发病时间的延长，伤口对病斑扩展的影响逐渐减小，说明病原菌侵染叶片后的扩展速度受伤口影响较小，而与病原本身特性有关。在室内接种条件下，5个牡丹品种间发病没有差异，说明其抗病性差异不大，但室外接种还需进一步验证。

A. alternata是植物病害的重要致病菌，多种植物病害均由A. alternata引起。如北柴胡、鱼腥草等的叶斑病（Zhang et al.，2010；Zheng et al.，2011）、花椒枯穗病（刘峰 等，2013），大樱桃黑斑病（赵远征 等，2013），菊花黑斑病（许高娟和陈发棣，2009）等。在希腊，Thomidis和Tsipouridis（2006）首次发现了A. alternata可引起樱桃叶斑病。本研究中首次明确了牡丹黑斑病的病原菌为

A. alternata。致病菌的准确鉴定，对于明确该病与牡丹其他病害的区别和进一步研究该病原的其他特性提供了理论依据。该病原菌的流行规律以及田间的致病性等需要进行深入的调查，对防治药剂的敏感性等也有待进一步的研究。

References

Duan Ya-bing. 2009. Study on the identification and biological characteristics of pathogenic fungi of peony leaf spot. Luoyang：Henan University of

Science and Technology. (in Chinese)

段亚冰. 2009. 牡丹叶斑病病原真菌鉴定及生物学特性研究. 洛阳：河南科技大学.