鱼卵提取物微量刺激法诱导鼠脾细胞表达干细胞标志抗原

中国组织工程研究 第16卷 第1期 2012–01–01出版

Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 1, 2012 Vol.16, No.1

鱼卵提取物微量刺激法诱导鼠脾细胞表达干细胞标志抗原*☆

阮光萍，姚 翔，庞荣清，王金祥，马丽花，王 强，邓永丽，潘兴华

A micro-stimulation method based on fish oocytes extracts induces mouse spleen cells to express stem cell mark antigen

Ruan Guang-ping, Yao Xiang, Pang Rong-qing, Wang Jin-xiang, Ma Li-hua, Wang Qiang, Deng Yong-li, Pan Xing-hua Abstract

BACKGROUND: The mouse and human somatic cells can be induced by some special factors to a state of embryonic cells

called as induced pluripotent stem cells. OBJECTIVE: To further enhance the efficiency of fish oocytes extracts on inducing somatic cells to differentiate into pluripotent stem cells.

METHODS: We compared a new method (micro-stimulation, 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 g/L fish oocytes extracts) to improve the

induction efficiency, and the traditional method (0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.2 g/L fish oocytes extracts) in cultured cells by adding fish oocytes extracts. RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the traditional method, the new micro-stimulation method could induce spleen

cells to express more stem cell marker antigens OCT-3/4, Nanog, SSEA-1. It is proved that the micro-stimulation method is a

more efficient way to generate pluripotent stem cells from somatic cells. Ruan GP, Yao X, Pang RQ, Wang JX, Ma LH, Wang Q, Deng YL, Pan XH. A micro-stimulation method based on fish oocytes

extracts induces mouse spleen cells to express stem cell mark antigen.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(1): 121-124.

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摘要

背景：小鼠和人的体细胞能被一些特殊的因子诱导，逆转为类似胚胎细胞的状态，即诱导性多能干细胞。 目的：进一步提高鱼卵提取物诱导体细胞逆向分化为多能干细胞的效率。

方法：以鱼卵提取物诱导BALB/C小鼠脾细胞分化为多能干细胞，分别以普通诱导法(鱼卵提取物质量浓度分别为0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.2 g/L)与微量刺激法诱导(鱼卵提取物质量浓度分别为0，0.05，0.1，0.2，0.4 g/L)。

结果与结论：与普通诱导法比较，微量刺激法诱导的脾细胞表达更多的干细胞标志抗原OCT-3/4，Nanog，SSEA-1。证明微量刺激法可进一步提高体细胞逆向分化为多能干细胞的效率。

关键词：多能干细胞；天然活性物质；脾细胞；干细胞标志抗原；微量刺激法 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.01.026

阮光萍，姚翔，庞荣清，王金祥，马丽花，王强，邓永丽，潘兴华. 鱼卵提取物微量刺激法诱导鼠脾细胞表达干细胞标志抗原[J].中国组织工程研究，2012，16(1):121-124. [http://wendang.chazidian.com http://wendang.chazidian.com]

有望成为实施再生医学和细胞治疗的重要细胞0 引言

来源。

诱导性多能干细胞研究之所以在短时间引

成体细胞逆向分化是一个热点问题，近期

起了人们巨大的关注，不仅在于它的科学价值，美国和日本科学家取得了重大突破，美国《细还因为它可从根本上解决干细胞研究的伦理问胞》杂志、《科学》周刊与英国《自然》杂志连题。胚胎干细胞需要破坏早期的人类胚胎，而续发表论文，指出小鼠和人的皮肤细胞能被一诱导性多能干细胞只需使用人类的皮肤细胞，些特殊的因子诱导，逆转为类似胚胎细胞的状通过几个干细胞因子的导入就能将人的皮肤细态，简称诱导性多能干细胞

[1-3]

，并已经取得初

胞逆向分化为诱导性多能干细胞，有极大的应步的治疗成果，引起了学术界和公众的极大反用价值。

响。目前，诱导性多能干细胞已经被用于治疗，OCT-3/4、Nanog、SSEA-1是几个干细胞2007－12－06美国《科学》周刊宣布，把诱导性相关蛋白，在早期鼠胚胎发育时表达在鼠胚胎多能干细胞和胚胎干细胞诱导分化为造血祖细干细胞上。为了证实诱导的脾细胞有大部分转胞，移植到小鼠体内能修复致命辐射带来的损化为多能干细胞，实验通过细胞形态观察，流伤[4]

。

式细胞仪分析细胞内蛋白OCT-3/4、Nanog的表诱导性多能干细胞是由体细胞诱导而成的达和细胞表面蛋白SSEA-1的表达，来鉴定利用干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能鱼卵抽提物微量刺激法诱导的BALB/C小鼠脾

性，在生物和医学领域具有广阔的应用前景，

细胞转变为多能干细胞的数量。

ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

Research Center of

Stem Cell, Tissue and

Organ Engineering, Kunming General

Hospital of Chinese PLA, Kunming

650032, Yunnan

Province, China

Ruan Guang-ping☆, Doctor, Attending

physician, Research

Center of Stem Cell, Tissue and Organ

Engineering, Kunming General

Hospital of Chinese

PLA, Kunming

650032, Yunnan

Province, China ruangp@http://wendang.chazidian.com

Correspondence to: Pan Xing-hua, Chief physician, Research Center of Stem Cell, Tissue and Organ Engineering, Kunming General Hospital of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China xinghuapan@ http://wendang.chazidian.com

Supported by: the

Social Developmental Program of Yunnan Province*

Received: 2011-05-21 Accepted: 201

1-07-04

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阮光萍，等. 鱼卵提取物微量刺激法诱导鼠脾细胞表达干细胞标志抗原

解放军昆明总医院干细胞与组织器官工程研究中心，云南省昆明市650032

阮光萍☆，女，1974年生，云南省昆明市人，汉族，2007年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事干细胞的基础与应用研究。ruangp@ http://wendang.chazidian.com

通迅作者：潘兴华，主任医师，解放军昆明总医院干细胞与组织器官工程研究中心，云南省昆明市 650032

xinghuapan@ http://wendang.chazidian.com

中图分类号:R394.2 文献标识码:B

文章编号:1673-8225 (2012)01-00121-04

收稿日期：2011-05-21

修回日期：2011-07-04 (20110610012/GW W)

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1　　材料和方法　

设计：干细胞诱导观察实验。

时间及地点：于2010－03/2011－04在解放军昆明总医院干细胞与组织器官工程研究中心完成。

材料：

实验动物：8~12周龄BALB/C小鼠购自云南

大学实验动物中心，雌雄各半，体质量17~21 g，产卵期鲫鱼购自当地菜市场。

抗体：抗人或鼠Oct-3/4-FITC单克隆抗体和

抗人或鼠SSEA-1-Percp 购自R&D 公司。PE标记的鼠抗鼠Nanog单克隆抗体购自BD公司。同型质控购自R&D 公司。

实验方法：

BALB/C小鼠脾细胞悬液制备：无菌取鼠脾，

用双抗浸泡，取出放于200目的筛网上，用注射器针蕊压碎，基础培养基冲洗，滤过筛网的细胞收集，氯化铵溶血1次，基础培养基洗1遍，倒掉上清，用完全培养基悬起，24孔板培养。

鱼卵抽提物的制备：取产卵期鲫鱼，部腹取

鱼卵，用生理盐水清洗干净后，加等量生理盐水，用搅拌机搅匀，离心1 000 r/min 10 min，取上清，再离心4 000 r/min 10 min，上清收集并过滤除菌，分装冻存于－20 ℃。

普通培养法诱导：检测鱼卵抽提物蛋白质量

浓度为40 g/L，取0，5，10，20，40，60 µL鱼卵抽提物分别加入2 mL小鼠脾细胞中，使鱼卵抽提物终质量浓度分别为0，0.1，0.2，0.4，0.8，1.2 g/L。培养一段时间后做流式检测OCT-3/4、Nanog、SSEA-1表达。细胞培养基为含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12。

微量刺激法诱导：将脾细胞离心，去上清，

悬于500 µL完全培养基中，分装于5个EP管，每管100 µL，将鱼卵抽提物质量浓度调整为 1 g/L，分别加0，5，10，20，40 µL于EP管中，则鱼卵抽提物终质量浓度为0，50，100，200，400 mg/L，放于37 ℃ 2 h，再转入24孔板中培养。该法由于刺激体积很小，所需的鱼卵抽提物也很少，非常节约试剂。细胞培养基为含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12。

细胞形态观察：培养12 d后脾细胞形态变化。 免疫组织化学分析诱导后脾细胞Nanog的表达：将培养3 d的脾细胞涂于玻片上固定，作免

疫组织化学，一抗为抗鼠Nanog抗原的抗体，二抗为标记HRP的羊抗鼠二抗，DAB显色。

流式细胞仪分析诱导后脾细胞表达干细胞标志抗原OCT-3/4，Nanog， SSEA-1：收集培养不同

时间的脾细胞，按流式标记步骤进行，流式抗体为抗鼠Oct-3/4-FITC，Nanog-PE，SSEA-1- Percp，标记好的细胞上流式细胞仪检测阳性率。SSEA-1是表达在细胞膜上的，细胞悬于100 µL FB中，加10µL SSEA-1-Percp，室温 30 min，FB洗2次，悬于400 µL固定液，等待上流式细胞仪检测。Oct-3/4和Nanog是胞内抗原，按胞内抗原检测的方法进行。细胞先悬于200 µL 40 g/L多聚甲醛的PBS，室温10 min，用SAP洗1次，悬于100 µL SAP中，加入10 µL Oct-3/4-FITC或加入20 µL Nanog-PE，室温 30 min，SAP洗2次，悬于400 µL固定液，等待上流式细胞仪检测。

主要观察指标：诱导后小鼠脾细胞形态变化及干细胞标志抗原OCT-3/4，Nanog， SSEA-1的表达。

统计学分析：应用SPSS 17.0统计学软件行方差分析，统计学处理由第一作者完成。

2　　结果　

2.1 诱导与未诱导培养小鼠脾细胞形态观察结果 脾细胞分为两孔培养，一孔加入诱导剂鱼卵抽提物，一孔不加诱导剂，培养12 d后形态观察。诱导后的脾细胞由圆形变为长梭形，并有部分贴壁生长，见图1。

a: Without induction

b: After induction, the spleen cells were changed from round into

long spindle shape, and some presented with adherent growth

Figure 1 Morphological observation of spleen cells

after induction and without induction for 12 d (×100)

图1 脾细胞诱导与未诱导培养12 d形态学变化

(×100)

P.O. Box 1200, Shenyang 110004 http://wendang.chazidian.com

阮光萍，等. 鱼卵提取物微量刺激法诱导鼠脾细胞表达干细胞标志抗原

2.2 诱导与未诱导培养小鼠脾细胞免疫组织化学检测结果 将不加诱导剂的脾细胞和微量刺激法诱导的脾细胞涂于玻片上，按免疫组织化学的步骤操作，最后DAB显色。结果表明微量刺激法诱导后有更多的脾细胞表达Nanog抗原，图中显示为棕色细胞，见图2。

a: Without induction

b: Fish oocytes extracts induced

Figure 2 Immunohistochemical results of spleen cells after

induction and without induction, brown cells were Nanog positive cells (×100) 图2 脾细胞诱导与不诱导培养的免疫组织化学结果，棕色

细胞为表达Nanog抗原的细胞(×100)

2.3 普通诱导法与微量刺激法诱导后脾细胞干细胞标志抗原OCT-3/4，Nanog，SSEA-1的表达

Oct-3/4-FITC阳性率：0.1g/L鱼卵提取物普通培养法

诱导7 d，Oct-3/4-FITC阳性率为1.6%，微量刺激法诱导后Oct-3/4-FITC阳性率为28.4%，见图3，差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明，普通培养法诱导时0.2 g/L的鱼卵抽提物是诱导Oct-3/4表达的最佳质量浓度，微量刺激法诱导0.1 g/L是诱导Oct-3/4表达的最佳质量浓度，与普通培养法诱导比较，微量刺激法诱导后多能干细胞的数量进一步增加，差异有显著性意义。

SSEA-1-Percp阳性率：不同质量浓度鱼卵提取物用两

种方法诱导后SSEA-1-Percp阳性率有明显不同，在相同质量浓度0.2 g/L诱导3 d后，微量刺激法SSEA-1- Percp阳性率为4.4%，而普通培养法SSEA-1-Percp阳性率为1.4%，见图4，5。

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