高迁移率族蛋白B1在肾脏冷缺血再灌注损伤中的作用

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２０１＇１９（４４）：８２９７｛３００

ｆｈｈｐ．ｍ州ｗｃｒｉｅｒｃｎ

摘要

背景缺ｍＩｑ滩＾Ｅ损伤足临来％目移植不ｆⅡ镕免的璃Ｒ生理过程件磷ｍｍ准Ｔ￡Ⅲ协其宵＂究肾社植更强的针对性。目的：观察高Ⅱ移车旗蚩向Ｂ１在大鼠肾脏片缺衄町沸｝ｊ：损伤中的作川。

方法：将ＳＤ人鼠随机分为能手术组冲缺ｍＩｑ搬注组、州喇醴Ｌ哺（可Ⅱ蒋抑制高迁移卑媛蚩ｎＢ１的台成与释放）治疗蚍。冷缺ｍⅣ潜律女ｌ和阿荆睦Ｌ酯☆疗ｍ制吩缺ｍ冉潜ｎ模型＃口升别”阴茎背静脉注射林格被ｂⅣ啊酸‘＆．假手术缃将怛脾打”ｎ”ｍ苹竹静脉Ｒ射韩格液．４５ｒａｉｎ后关闭腹腔。

结皋与结论：坪缺ｍ再端洼组ⅫＷ酮醴￡酪治＂组备时¨点肌酐、高旺移牢族置ｎＢ１、＂Ⅻｑ－死目Ｔａ、植因了ＫＢ水平均疆辅岛ｒ假Ｆ米ｍ（Ｐ‘００１），韭ｃ｛｜冷缺血再＃＊组ｈ述指标商丁丙酮酸￡＆＊，７Ⅲ（Ｐ‘００，）。袁明蜥迁移毕《生自参１ｊ７肾社机ｎ缺ｍⅣ罐；ｔ∞稿理过程．丙耐陵￡商能够减轻肾脏冷Ｒ血Ⅳ灌７Ｉ：损伤。关键词：“址移｛壤ｍｒｌＢ１：月目聃￡酌：缺血孵满ｆｆ授伤肾社辅ｄｏｉ：１０３９６９９ｊｉｓｓｎｌ８阳≈２２５２ｎ｛ｔ４４０３２

¨‘．粒州，ｄ炳毂．牛Ｍ利．Ｔ爽口Ｉ敢．柯１＃妍，≈址侈牢族蛋ｎ

桂研究‘Ｉ临床鹰复．２０１１，１５（“）＝８２９７－８３００

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Ｂ１

ｎ肾脏ｎ缺ｍ『ｑ＊ｎ损伤ｔ｝－∞作用【Ｊｌｒｌｌ圆组织Ｉ

ｚｇｌｃｋｆ

ｃｒｔｅｒ蜘ｈｔｔｐ：ｌ／ｃｎ

ｃｏｍ】

系统是机体在长期进化ｉ｛，逐步形成的一套机制

０引言

复杂的防御系统，包括天然免疫和获得性免疫。

现已Ｊ泛认为，获得性免疫的激活需要先天性

移植肾冷缺血所造成的冷缺血冉蠹注损伤是临球器仃移植不町避免的病理生理过程．是慢性移植肾病的危险因素２一。供肾的冷缺血时间是造成肾移植患者术后发生移植肾功能延迟恢复的主要原崩，而移植肾功能延迟恢复和急性排斥反应的发生是影响肾脏存活时问的重

免疫系统的参与，尤其是先天性免疫系统中的

ＴＬＲｓ家族，它们是先天性免疫的信号发动受

ｗｅｉｘｉｎ９３０９＠

ｄｍ”女：＃∞

体，ＴＬＲｓ除了识别病原丰【『火的分于模式，如细

菌、病毒、寞莳和原虫外，同样能识别多种因

８自＃植十ｕ＊

％一＃，ｎ｛￥

素引起损伤时受损细胞域坏死细胞释放的内源性配体．如热休克蛋ｒｊ、高妊移宰族蛋白

Ｂ１ｆｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｂｏｘ１，ＨＭＧＢＩ）等，进

ｃａｉｍｉｎ９２Ｃ０２＠

要因素ｎ

姬≈。研究发现，炎症、免疫反应垂与了缺『吐Ｉｔ｝潍注坝伤。缺血再灌注过程中炎瘟细胞聚蜒增血】、细胞网子表达ｒ调及Ｔ细胞介导的免疫

Ｊ豆应等是造成肾组织损伤的拳要因素…。免疫

而引发一系列的炎症反』衄口Ｊ。既往的研究多针对于肾脏热缺血再灌注损协，而玲缺血再灌注损伤更好的模拟了移植肾保存过程，具有更加重

要的研究价值。

ＩＳＳＮｌ６７３－８２２５ＣＮ２１—１５３９／ＲＣＯＤＥＮ．ＺＬＫＨＡ，＇－：

８２９７

ｌ讨分别经阴茎背静脉注射丙喇酸已陆３

１材料和方法

２６

ｇ／Ｌ（溶ｊ林饼

液１ｍＵ｛，），儿余步骤同拎缺血再灌沣纲。

假手术组：３％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，耿崾

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：ｊ‘２０１０－０１／１２在解放半第３０９医院动

物实验中心完成。

材料：

部正中切１：３，显露般侧肾蒂，经刚苹背静脉给ｒ㈨采

１０００

ＵＩ蛔，４５ｒａｉｎ后关闭腹腔。

标本处理：各纽均于于术后６ｈ、１ｄ、３ｄ、５ｄＩ杖ｒ

胜静脉血检测血肌酐水平，应用ＲＴ－ＱＰＣＲ方法检测核

因子ＫＢ、肿瘤坏北因子ａ，处死动物后取肾肼组织标木，

实验动物：健康消洁级ｓｐｒａｇｕｅ?Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）雄性太鼠６０Ｈ，鼠龄１年．体质量２００－２５０ｇ，由ｑ?囝医学科学院肿瘤医院实验动物中心提供，证书编号：ＳＣＸＫ（京）

２００９．００１７。

应用Ｗｅｓｔｅｍ—Ｈ０ｔ检测肾组织ＨＭＧＢｌ表达悄Ｉ兕。

血液生化分析：３％戊巴比妥钠腹刖，麻醉后，胸腹联合剀ｕ，直视下从Ｆ崩，静脉拙耿２ｍＬ血液，静置３０ｍｉｎ后常温７５００９离心．取ｌｍ清以ｔｊ＝ｎ动卞化分忻仪测定肌酊水、Ｆ。

主要试剂与仪器：

试剂目仪＊

阳喇酸Ｌ酯，Ⅲ林格被稀释成

３２６

来ｇ

Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ

实时荧光定量ＰＣＲ检测：①引物设计：Ｈ的基因Ｒｅａｌ

Ｔｉｍｅ

ＰＣＲ榆测引物。②提取样本总ＲＮＡ：用超纯ＲＮＡ

提取试剂盘提取组织样本中。曹，ＲＮＡ。实验操作按产晶｜兑明书进行。＠电林：取５ｐＬＲＮＡ用１％琼脂糖凝胶进行电泳。④反转采用ＨｉＦｉ—ＭＭＬＶｃＤＮＡ第１链台成试剂盒进行

反转采。

Ｒｅａｌ］３ｍｅＰＣＲ：仪器及分析方法用ＡＢ７５００型荧光

ｇ／Ｌ（一Ⅱ％著抑制高辽牡率

族蛋白Ｂ１的合成’，释放１

超纯ＲＮＡ提“ｍｄＵ盘

定最ＰＣＲ仪，采用２“““法进行数据的相村定量分析。操作过秤如下：反应体系：爿ｊＵｌｔｒａＳＹＢＲＭｉｘｔｕｒｅ（ｗｉｔｈ

ＨｉＦｉ－ＭＭＬＶｃＤＮＡ第链台成∞

Ｒｏｘ）进｛ｒ扩增，史验操作按产品说明忙进行。扩增狸Ｊ≯

为：９５℃１０ｍｉｎ（９５℃１５ｓ，６０℃６０ｓ）ｘ４０个循环。加入火苗然馏水车２０ｕＬ。

ｅａｓｙｂｉｏ

刷盘

荧光定坫ＰＣＲ仪

筮“抽提Ｍ剂、ＢＣＡ蛋自定量试剂盘

Ｆｒｅｓｃｏ低温砖冻离心机，ＭｕＲｉＳｋａｎ３酶标仪

Ｗｅｓｔｅｍ－ｔＹ㈣：①ＢＣＡ法蚩ｎ定量ｒ准备ＢＣＡＴ＿作

ｎｍ

液Ａ液：Ｂ液＝５０：１，稀释立于各个提取ＢＳＡ标准品。样品用ＰＢＳ进行稀释１５倍。②样品：ＢＣＡＩ作液＝１：８，混匀后３７℃孵育３０ｒａｉｎ或者宦温孵胄６０ｍｉｎ，酶标仪５７０波长滤光片读取＾值。③蛋白浓度调整以刚ＰＡ调整虽白

实验方法：

浓度，加入５ｘ还原样晶缓冲被后样品终质戢浓度为４ｇ／Ｌ。

实验动物分组：将６０儿ＳＤ大鼠随机分为假手术组（ｎ＝２０）、冷缺血再灌注组（ｎ＝２０）、丙酮酸乙酯治疗组（ｎ＝２０）。

冷缺血再灌注模型制作：３％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取腹部正。｛，切ｕ，显露右肾蒂．显微弹簧镊游离右肾蒂后

煮沸变件５ｍｉｎ。④ＳＯＳ－ＰＡＧＥ：根据Ｈ的蚩门的分子量，

配ＳｒＪｌ２％分离胶，浓缩胶浓度为５％。待检测蚩自样品ｌ。样鞋：上样２０ｌＪｇ。电泳条件：浓缩脞陌压９０Ｖ，约２０ｍｌｎ，

澳酚蓝进行分离胶界面；分离殷恒压１６０ｖ．电泳至澳酚

蓝到凝胶底部。用＿母马斯亮蓝染色液进行染色。

１号丝线垂线，备结扎用。游离左侧肾蒂、肾及输向｛管，

经阴茎背静脉给予肝索１０００Ｕ／ｋｇ，１ｍｉｎ后沿左肾动脉根部咀无损伤血管灾阻断肾动、静脉（维持４５ｒａｉｎ）．套管

主要观察指标：①再组血清肌酐水、ｒ。②各组肾组织ＨＭＧＢｌ、肿瘤坏死冈子ａ、核园子ＫＢ水平。

统计学分析：数据由作者采用ＳＰＳＳ１８统¨软件进行统计学分析，最终计量资料采用Ｘ±Ｓ表不，若数据｜Ｊ３组．组｜日］比较采用单因素方差榆验，若数据为两纽，则

应用ｔ检验，户＜００５为差异有显著性意义。

针穿刺肾动脉，肾静脉剪开约１ｍｍ大小开口，０＂４℃肾

保存液（１－３ｍＬ）恒压灌注（６０ｃｍ高币力连续灌注），见肾

脏颜色变苍白，肾静脉引出液体清亮停止灌注；显微镜（８倍）下分别以１ＧＯ、９－０无损伤缝合线缝台肾动、静脉扦ｕ。

肾蒂阻断状态Ｆ低温保存，４５ｍｉｎ后复港。观察无出血，

２结果

左肾灌注良好，色泽红润，腹腔给予肯瓣索关ｃｌｊ切Ｉ１。冷

缺血再灌注组缺血前２０ｒａｉｎ及再灌｝㈨“分＊０经刚茎背静脉注射林格液：内酮酸乙酯治疗组缺血Ｆｉｌｌ２０ｍｉｎ及再灌注

２１

实验动物一般情况６０．ｕ，夫鼠在手术过程及实蛳

期间均存活良好。

ＰｎＢｏｘ１２００，Ｓｉ’ｅｎｙａｎｇ

１１０００４

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ｎ惜ｍａ‰女ｍ＊ｎ＊％÷∞＃％

２．２各组大鼠血生化分析结果冷缺血再灌注组和丙

酮酸己酯治，，组肌酐水平显著高于似手术组（Ｐｃ００１）：冷缺血再灌注纽均硅著高于丙酮酸乙酯治疗组ｆＰ‘０ｏｉ），见表１。

＾１＊纽太鼠山ｍＬＨ．】勺№轻

Ｔ８ｂｌｅ＇ＳｅｎＪｍｒｅａｔｉｎｅｎｅｏｆｍＩｓ

集中在以太鼠热缺血再灌注为模型的动物实验，提示内

源性配体ｆＨＭＧ８…ｊＴＬＲｓ结台能诱导树突状细胞的成熟，除了产生细胞因子和化学因子，成熟的树突状细胞

表而共同刺激分子能提供“第『二估号”给Ｔ淋巴细胞“。ＴＬＲｓ与配体结合后在树突状细胞ｑ，通过Ｔ辅助细胞（ＴＨ

ｅｘｂｏｓｅｅｌｏｃｏ“ｉｓｃｈｅｍｉａ，

（胜ｓ．胪２０，ｐｍｏｔ／Ｌ１

细胞】撤活来引发效应．反之，若缺乏ＴＬＲｓ的外源性和内源性配体。那么ＴＬＲｓ无法激活，则树突状细胞成熟障碍，而未成熟的树突状细胞不能启动Ｔ淋巴细胞反应。另外，损伤程度可影响树突状细胞的成熟过程．较大的损伤能引起树突状细胞的成熟，诱导获得性免疫，促进ＴＨｌｌ｛ｌ｜胞或ＴＨ２细胞分化，增加Ｔ淋巴细胞记忆；但损伤较轻或者没有损伤刺激时，树突状细胞则为半成熟或

者未成熟状态，不能诱导Ｔ淋岜细胞快速分化，而Ｔ淋巴

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２３实时荧光定量ＰＣＲ检测结果备标准曲线的酽均

达）Ｕｏ９９，说明线性相光度很高，口扩增效率均在９０％

细胞在移植免疫排斥中起十分霞要的作用。

２

３

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以上，熔解曲线峰呈单峰，特异性强，㈥此可采用此种

方法和以Ｐ引物进行后续样奉的扩增分析。

报槲ＲｅａｌＴｌｍｅＰＣＲ原始榆测结粜，按照２也‘“相对定量¨掉公式．ＢＵ

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计算出各样品的目的基因相埘定晕结果：冷缺血弭灌注组肿卿坏死因子ａ、核网子ＫＢ水平均显著高ｒ丙酮酸乙酯治疗组ｆＰ

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Ｏｏｉ），见表２。

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图１

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Ｔ细胞激活有赖于取信号，目ＵＴＣＲ特异性识别抗原提呈细胞所提呈抗原肤而产生的第一信号．以及抗原提

是细胞与Ｔ细胞表耐共刺激分予柑１Ｌ作用所提供的第二信号。南此可见，抗原提早细胞在Ｔ细胞应答过程中占

３７６±０３４４２０±０３７

‘０

３１７４±０２８

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据重要地位。近１０年来提出了危险模式理论，从固有免疫和获得性免疫相互关系的角度强调了抗原提呈细胞在Ｔ细胞激活过程中的重要作用，其要点是：各种导致组织损伤的触发剂（即危险信号）均可诱导抗原提呈细胞活

化并表达共刺激分子，从而提供Ｔ细胞活化的第二信号。换言之，组织损伤所致的危险信号是激活抗原提呈细胞、继而激活Ｔ细胞的关键环符。

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Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ植－测各组ＨＭＧＢｌ蛋白水平结果拎

缺血再灌注组和丙酮酸乙醣治疗组％ＰｔＭＧＢｌ水，Ｆ显著

高ｒ假下术组（Ｐ

ｔ

０

０１）；丙酮酸己酯治疗组显著低于

同种器官移植中，供体的冷缺血再灌注损伤围素无法避免，使受者体内出现细胞应激和炎性”瀑布式”反应，

町产生多种内源性危险信号，从而激活抗原提呈细胞并诱导同种反应惟Ｔ细胞活化。因此，阻断内源性危险信号乃抑制冷缺血再灌注损伤的重要策略。

冷缺血阿艘注组（Ｐ《００１）．见圈１。

３讨论

枉ｌｊ前同山艘闻外的研究中．针对ＨＭＧＢＩ的研究

ＩＳＳＮｌ６７３－８２２５

ＣＮ２ｆ－１５３９／Ｒ

ＣＯＤＥＮ：ＺＬＫＨＡＨ

肾脏拎缺【缸再灌注损伤研究符台临床肾脏移植的

Ｉ睡Ｆ露７；露…。。

实际情况，仃较高的致性，对于ＨＭＧＢｌ自ｌ何启动冷缺血再灌沣损伤后的获得性免疫反瞳机制的研究，对于

Ｈ４＊∞ｔ＃＃＃女｝｜Ｂ１ｎ＊＊口＃ｎｎ＊｛ｔ＊ｍｒ｜，∞＃Ⅲ

细胞所识别的足…＿ｊ组【织损伤或炎症反应所产乍的“危险佑吁”，微生物及其代酣产物兆宵的稍原丰１｛关的分子

延长供肾的慊存时间，减少肾移植后移植肾功能延迟恢复发急性排斥反应的发生，提高移植肾的半寿期，具有

堕整的临床意义。

模式是主要的外源件危险信号；机体组纵损协时所产生

的热体克蛋自、ＨＭＧＢｌ等为内源性危险情号，这此分

子办被称为损伤牛｝ｊ芙的分子模式，这一理沦为阐明急性

ＨＭＧＢｌ是一种胞内广泛存在高度保守的ＤＮＡ结合

蚩白，具有稳定核酸结构、调节转录和基因表达等多种功能。长期以来人们仪仪了解ＨＭＧＢｌ的核内功能，但

排斥反应发生机制提供了令人信服的新思路…训。

本实验证实．大鼠肾脏冷缺血冉灌注损伤后，ＨＭＧＢｌ表达升高，肾功能指标肌酐及炎症因子肿瘤坏死因子ａ、核因子ｌ（Ｂ水平也相应升高，考虑ＨＭＧＢｌ引起肾脏冷缺血再灌注损伤机制为通过结合ＴＬＲ４而诱导树突

状细胞成熟，继而激活Ｔ细胞发生获得性免疫。应用丙酮

近年研究显示它还具备多种细胞外效应。例如，细胞释放ＨＭＧＢｌ至胞外发挥促进细胞分化、触发及调节炎症等作用…。其释放至胞外３蔓通过两种机制：①通过受损组织中损伤或坏死细胞而非凋凸啊胞被动释放，坏死细胞释放的ＨＭＧＢｌ作为危险信号诱导其他细胞发生非‘Ｌ理性死亡ｐ｝。②包括巨噬细胞和中性粒细胞在内的炎

症细胞主动分泌。在这一主动分泌过程中，ＨＭＧＢｌ酋先经乙酰化并由核内转移至溶酶体内，继而在ＡＴＰ和溶血磷脂胆碱两种分泌信号作用下转移至细胞外…。

酸乙酯进行『－颅性治疗可以降低ＨＭＧＢｌ的表达，并且减少炎症闻于的水平，减轻肾脏冷缺血再灌注损伤。

４参考文献

ｆ１１

Ｒｅｑｕｉ自ｍＭｏｕｒａＬＲｒｅｐｅｄｕｓｉｏｎＩｎ｝ｕｗ２０１１；４３（１ｌ：７“７３

ＢｅｎＭｋａｄｄｅｍｓ．Ｃｈａｓ，ｉｎ

ｔｕｂｕｌｅ

ｏｎｌｏｎｇ－ｔｅｎ口哦ｆｕｎｅｔｉｏｎ

ｄｅＳ彻Ｄｕ日ｏＭ

ＨＭＧＢｌ既是炎症的早期启动者（ＨＭＧＢＩ从坏死细胞的

被动释放），又是炎症晚期的促进者（臣噬细胞主动分泌ＨＭＧＢｌ）。值得注意的是，Ｆｈ坏死细胞被动释放的

口】

ＣＶａｎｄｅｗａｌｂＡｃｏｎｔＨｂｕ＃∞ｏｆ…Ｉ

ｆ３１

ＨＭＧＢｌ与巨噬细胞上动分泌的ＨＭＧＢｌ在分了特性上

有所差异，即丰动分泌的ＨＭＧＢｌ分了灶乙酰化的。

多种细胞网子能刺激ＨＭＧＢＩ的释放。脒了脂多糖、

川

ａｌ

ｂａｃｔｅｒ∞ｌ｝ｒｉｆｅｃｔｉｏｎｓａｎｄｉｓｃｈｅｍｉａ—ｒｅｐｅｒｆｕａｉｏｎｌｎＩｕ～ＣｈａｎｇＧｕｎｇＭｅｄＪ２０１０；３３（３）：２２５－２４０

ｗｕＨＬＭａＪＨＭＧＢｌＣｏｎｔｔｉｂｕｔｅａｔｏＫｉｄｎｅｙｌ％ｈｅｍ目

ＲｅｐｅｃｆｕｓｉｏｎｉｎｔｕｍＪＡｍＳＯＣＮｅｐｈｒｏｌ２０１０；２１１８７８－１８９０

ＩｋｅｄａＭＰｒａｃｈａｓｉｉｃｈａｌＷＩｓ∞ｅｍｉｃａｃｕｔｅｔｕｂｕｌａｒＮｅｃｒｏｓｉｓｍｏｄｅ（ｓ

ｅｐｉｔｈｅｌｉａ｛∞¨ｓＩｎｔｈｅｆｎｎａＩｅｌｔｅ

ｍｍｕｎｅ……ｄｕｎｎｇ

Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄ

ＴｍｎｓｐｌａｎｔＰｔＯｃ

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肿瘤坏死因子、白细胞介素１Ｂ能刺激巨噬细胞、单核细

胞和垂体后叶细胞（不能刺激原始Ｔ细胞、肾上腺细胞、

ｑ可ｑ

肾细胞）以一种时间剂量依赖方式释放ＨＭＧＢｌ外，干扰素ｖ也能协『刊其他细胞因了刺激ＨＭＧＢｌ的台成。单独干扰素ｖ不能刺激ＨＭＧＢｌ的释放，但干扰素ｖ与肿瘤坏死

因子或白细胞介素１共同刺激则可使ＨＭＧＢｌ的产生增

加３—５倍Ｈ。同时ＨＭＧＢｌ也刺激促炎细胞因于的合成，蒙其他细胞斟ｆ介导的内毒索血癌一样．ＨＭＧＢｌ在人类外周血电核细胞叶１能刺激促炎因子的合成，辟ｊ纯化的

ＨＭＧＢｌ加入雕核细胞培养物巾，可以明显刺激肿瘤坏死因子、向细胞舟素１、白细胞介素６、白细胞介素８、ＭＩＰｌ的产生，但不产生白细胞介索１０和白细胞介索１２”１。最近发现，ＨＭＧＢｌ也能刺激人中性粒细胞表达多种促炎细胞园ｆ升可；ｒ起核因子ＫＢ的核移位…。因

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此，ＨＭＧＢｌ不仪在促炎吲子作用Ｆｒｈ单核巨噬细胞、中性粒细胞释放，其本身叉可引起延迟反应，维持和延

长了炎症反应。

实验研究ｚＩ，，阻断胞＃ＦＨＭＧＢｌ的活性，己成为Ｉ。

颅相关疾病过程的重要策略。丙剩酸乙酯是美圆食。％和

捌研

药品管理局划分为无毒性物质的一种食品添加剂，由丝

著的抑制ＨＭＧＢＩ的合成与释放作用，对器官缺血冉灌注

损伤有保护作用，时其进行进步研究具有重大的临眯

价值。

１９９４年提出“危险模式理论”，韩要点为：树突状

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